Manual de Técnicas de Cultivo y Aislamiento de Microorganismos

Técnicas de Cultivo y Aislamiento de Microorganismos

Medios de Cultivo

Medios para Bacterias

• Agar nutritivo: Medio de cultivo para microorganismos poco exigentes.
• Agua peptonada: Medio de cultivo líquido para aislamiento previo no selectivo de bacterias. Incubación: Aproximadamente 18 horas a 37ºC.
• Agar sangre (pH 6,8): Para aislamiento, cultivo y determinación de diversas bacterias.
• Agar S.S. (Salmonella–Shigella): Estimula el desarrollo de bacterias Salmonella y Shigella. Incubación: 18 – 24 horas a 37ºC.
• Agar McConkey: Aislamiento de Salmonella, Shigella y bacterias coliformes. Incubación: 18–24 horas a 37ºC.
• Agar X.L.D. (Xilosa Lisina Desoxicolato): Aislamiento y diferenciación de enterobacteriáceas patógenas, Shigella y Salmonella. Incubación: 48 horas a 37ºC.
• Agar Baid Parker: Aislamiento de Staphilococcus. Incubación: Desde 24 hasta 48 horas a 37ºC.
• Agar Cetrimide: Cultivo para Pseudomonas. Incubación: Hasta 48 horas a 42ºC.
• Medios que contienen azúcares más indicadores de pH: Estudiar propiedades fermentativas de las bacterias.
• Medio Kligler: Identificación de enterobacteriáceas. Incubación: Hasta 48 horas a 37ºC.
• Agar citrato: Identificación de microorganismos, enterobacteriáceas. Incubación: 24–48 horas a 37ºC.
• Caldo M.R–V.P. (Rojo de Metilo–Voges Proskauer): Diferenciación bioquímica, grupo Coli–Aerogenes. Incubación: Hasta 4 días a 37ºC.
• Caldo–lactosa: Escherichia coli demuestra por la formación de gas. Incubación: 24–48 horas a 37ºC.

Medios para Hongos

• Agar papa dextrosa: Cultivo, aislamiento y determinación del número de microorganismos de levaduras y mohos. Incubación: Hasta 5 días a temperatura ambiente.
• Agar Sabouraud: Medio de cultivo claro, recomendado para el cultivo de dermatofitos y para el ensayo de sensibilidad de hongos.

Procesamiento de Muestras Según su Naturaleza

Muestras Sólidas

• Metacarpo o Metatarso para siembra de médula: Aserrar la pieza, quemar la superficie, exponer la médula con una espátula al rojo y extraer la muestra con una pipeta.
• Trozo de órgano o Tejido: Extraer un trozo y triturarlo hasta reducirlo a una pasta. Suspender en solución salina.
• Heces: Suspender en solución salina.
• Pelos y Escamas para la identificación de hongos: Clarificar con lactofenol, cortar y sembrar al igual que las muestras de escamas.
• Anaerobio esporulado en tejido: Triturar el tejido y suspenderlo, calentar a 80ºC por 30-60min para eliminar la flora contaminada.

Muestras Líquidas

• Abscesos: Los espesos se suspenden en solución salina.
• Drenajes de oído: Suspender en solución salina.
• Esputo: Suspender en solución salina con descontaminante.
• Orina: Realizar diluciones, centrifugar a 1500rpm y sembrar. Procesar dentro de 2 horas de tomada y refrigerada.
• Sangre para hemocultivo: Usar sangre líquida con anticoagulante.
• Contenido intestinal: Centrifugar.

Enriquecimiento

Métodos Físicos

• Bajas temperaturas de incubación para Psicrófilas: 0º y 5°C, retardando el crecimiento de otros microorganismos.
• Alta temperatura de incubación para Termófilas: Superiores a 55°C, impidiendo el crecimiento de otros microorganismos.
• Alta temperatura para esporulados: 80ªC, destruidas sólo las esporas.

Métodos Químicos

• Enriquecimiento ácido para Lactobacilos: Caldo MRS, contiene fosfato disódico, acetato sódico, citrato amónico, sulfato de Magnesio. El medio debe quedar a un pH final 6,5. Aislar en el mismo medio MRS, solidificado, a pH final 5,5. Incubar los cultivos por 18-24hrs a 35°-37°C.
• Enriquecimiento con Selenito para Salmonella: Selenito de sodio a una concentración de 0,4% suprime temporalmente el crecimiento de coliformes, mientras continúa el crecimiento de Salmonella. Sembrar directamente sobre el medio e incubar por 12-16hrs. entre 35º a 37°C. Luego, proceder a aislar.
• Enriquecimiento con cloruro de sodio para Staphylococcus: Enriquecer con NaCl e incubar por 18-24hrs a 35°-37°C. Aislar en Agar Bair Parker, que permite la detección, enumeración y aislamiento. El medio contiene litio y telurito potásico para suprimir el crecimiento de otros microorganismos. Incubar las placas a 37°C por 24hrs.
• Enriquecimiento con antibióticos: Penicilina, a concentraciones de 194 U/ml. Aislar.
• Enriquecimiento con sales biliares para bacterias intestinales: Se adicionan sales biliares en Agar MacConkey o Salmonella-Shigella agar; y para Enterococcus en Bilis-esculina agar.

Aislamiento

El aislamiento corresponde al proceso que permite separar uno o más microorganismos de una muestra determinada, hasta obtener cultivos puros de ella. Para tal objeto se debe sembrar en medios nutritivos sólidos en placas de Petri, en forma tal que asegure el crecimiento de colonias bacterianas separadas y se evite el desarrollo en masa. En la generalidad de los casos, una colonia presumiblemente desarrollada a partir de una sola célula, es suficiente garantía de pureza.

Luego de obtener una cepa pura es posible estudiarla en sus distintos aspectos morfológicos y bioquímicos, para así lograr su correcta identificación.

Métodos de Aislamiento

Métodos mecánicos

• Método de reloj (agotamiento por estrías): Distribuir la siembra en una pequeña área junto a su borde y arrastrar un poco de bacterias a otra zona de la placa, en zig–zag.
• Dilución y siembra homogénea: Si la muestra está muy concentrada, hacer diluciones y sembrar homogéneamente hasta obtener colonias separadas.

Observación de los cultivos

• Rotular con fecha y número.
• Incubar a temperatura óptima, con las placas de Petri invertidas para evitar la deshidratación.
• Observar cada 24 horas.

Material de Laboratorio y su Utilización