ESTUDIO DE LOS LÍPIDOS. DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS TOTALES

1. INTRODUCCIÓN

Los lípidos son sustancias orgánicas muy heterogéneas tanto desde el punto de vista estructural como por las funciones que desarrollan en las células.

Químicamente, los lípidos están formados por C, H, O y también pueden contener P, N y S; la cantidad de oxígeno en estos compuestos es muy inferior a la de carbono e hidrógeno, lo que determina sus propiedades (apolaridad).

Tienen en común que son poco o nada solubles en agua y suelen ser solubles en disolventes orgánicos (éter dietílico, benceno, cloroformo, alcohol…).

Las principales funciones de los lípidos en el organismo son las siguientes:

  • Fuente de reserva de energía. Los triglicéridos, ocupando menos volumen que otros principios inmediatos, pueden producir más calorías.
  • El depósito de grasas bajo la piel sirve como protección frente al frío.
  • Forman parte de componentes estructurales celulares como las membranas celulares o la mielina del sistema nervioso.
  • Actúan como agentes emulsionantes (detergentes), ya que los ácidos biliares se forman a partir del colesterol.
  • Algunos lípidos modulan algunas actividades fisiológicas como:
    • Vitaminas liposolubles (A, D, E, K).
    • Hormonas (hormonas esteroideas como la progesterona, estriol, estradiol, testosterona, cortisol y aldosterona).
    • Prostaglandinas (sustancias lipídicas con acción similar a las hormonas).

2. CLASIFICACIÓN DE LÍPIDOS Y LIPOPROTEÍNAS

Los lípidos pueden clasificarse en dos grandes grupos:

2.1 Lípidos Saponificables

Su molécula contiene ácidos grasos que son ácidos monocarboxílicos que pueden contener insaturaciones (dobles enlaces) y están esterificados. Son lípidos que pueden hidrolizarse formando jabones por hidrólisis alcalina.

2.2 Lípidos Insaponificables

Son derivados de hidrocarburos lineales o cíclicos insaturados, tienen dobles enlaces que forman estructuras moleculares diversas. No tienen ácidos grasos en sus moléculas y, por tanto, no forman jabones.

Los principales lípidos presentes en el plasma son:

  • Triglicéridos o grasas neutras.
  • Colesterol (libre y esterificado).
  • Fosfolípidos.
  • Ácidos grasos libres.

Los triglicéridos son ésteres de glicerol y ácidos grasos y la principal forma de almacenamiento energético. El origen de los triglicéridos exógenos es la grasa de la dieta, mientras que los triglicéridos endógenos proceden de la síntesis hepática. Las fracciones endógena y exógena de los triglicéridos se distinguen por su medio de transporte en el plasma, VLDL y quilomicrones, respectivamente.

El colesterol es importante como precursor de las hormonas esteroideas y de los ácidos y sales biliares; tiene su origen en la dieta y en la síntesis endógena, principalmente hepática. Ambas fracciones, colesterol endógeno y colesterol exógeno, son indistinguibles.

Los fosfolípidos son lípidos complejos formados por glicerol, ácidos grasos, ácido fosfórico y, en ocasiones, otros componentes polares (base nitrogenada, aminoácido o alcohol).

Los ácidos grasos libres se encuentran en el plasma en baja concentración. Tienen su origen en la hidrólisis de los glicéridos en glicerol y ácidos grasos a nivel del tejido adiposo; circulan unidos a la albúmina y son rápidamente metabolizados.

Normalmente, los lípidos plasmáticos no circulan libremente disueltos en el plasma, sino que están unidos a proteínas denominadas apoproteínas o apolipoproteínas, formando unos complejos macromoleculares denominados lipoproteínas. Estas lipoproteínas constituyen el medio de transporte de los lípidos en el torrente sanguíneo, tienen una forma aproximadamente esférica y poseen una estructura interna compuesta por lípidos apolares o hidrofóbicos, triglicéridos y ésteres del colesterol. Sobre estos, se encuentran lípidos polares, menos hidrofóbicos, como el colesterol o los fosfolípidos, y en su superficie encontramos las proteínas.

Las lipoproteínas se clasifican según sus propiedades fisicoquímicas que se manifiestan en técnicas analíticas como la electroforesis y la ultracentrifugación. De esta forma se diferencian cuatro tipos de lipoproteínas:

  • Quilomicrones.
  • Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL – Very Low Density Lipoprotein).
  • Lipoproteínas de baja densidad (LDL – Low Density Lipoprotein).
  • Lipoproteínas de alta densidad (HDL – High Density Lipoprotein).

Los quilomicrones y las VLDL son las lipoproteínas encargadas del transporte de los triglicéridos, mientras que las LDL y las HDL transportan principalmente el colesterol.

CUADRO!!!! (Nota: Se necesita agregar un cuadro con la clasificación de las lipoproteínas y sus características)

3. METABOLISMO DE LOS LÍPIDOS

Los lípidos almacenados en el tejido adiposo son fundamentalmente triglicéridos y constituyen la principal reserva energética del organismo.

En estados de inanición, fiebre, frío, ejercicio intenso, diabetes mellitus descompensada… se produce una rápida movilización de los triglicéridos, que se hidrolizan a glicerol y ácidos grasos, pasan a la sangre y son captados por las células de órganos y tejidos donde son degradados para obtener energía.

El glicerol se convierte fácilmente en gliceraldehído-3-fosfato y continúa la ruta de la glucólisis y el ciclo de Krebs. Los ácidos grasos siguen una ruta catabólica especial denominada β-oxidación.

La β-oxidación consiste en un proceso degradativo de los ácidos grasos con el que se obtienen moléculas de acetil-CoA (unidades de dos átomos de carbono). El acetil-CoA generado se incorporará al ciclo de Krebs, donde se produce ATP, CO2, H2O y electrones; estos últimos se incorporan a la cadena respiratoria hasta el oxígeno molecular en el proceso denominado fosforilación oxidativa, mediante la que se obtiene más ATP. Los enzimas necesarios en la β-oxidación se localizan en el interior de las mitocondrias.

Los ácidos grasos de cadena larga (localizados en el citoplasma) deben sufrir una activación enzimática para poder ser transportados al interior de las mitocondrias. Esta activación está catalizada por la acil-CoA sintetasa. El acil-CoA resultante, para ser transportado al interior de las mitocondrias, debe unirse a una molécula transportadora, la carnitina.

El hígado de muchos vertebrados, en períodos de intensa formación de acetil-CoA a partir de ácidos grasos procedentes del tejido adiposo y a la utilización del ácido oxalacético para sintetizar glucosa, satura el ciclo de Krebs. Entonces, el acetil-CoA se emplea para formar ácido acetoacético y ácido β-hidroxibutírico, que pueden ser utilizados por otros tejidos. Estos compuestos, junto a la acetona, se denominan cuerpos cetónicos.

Los cuerpos cetónicos, sintetizados en el hígado, pasan a la sangre, que los transporta a los tejidos periféricos donde son utilizados. Su concentración en sangre es normalmente baja; sin embargo, en algunas situaciones metabólicas como el ayuno prolongado y la diabetes mellitus, aumentan los niveles en sangre de los cuerpos cetónicos, lo que conduce a un descenso del pH sanguíneo (acidosis). Hoy día se sabe que son importantes como fuente de energía para órganos como el hígado, riñón y miocardio; el cerebro prefiere utilizar glucosa, pero en caso de ayuno y diabetes se adapta a utilizar acetoacético. En el aliento de una persona que tenga un nivel alto de cuerpos cetónicos en sangre puede detectarse olor a acetona.

Se usan distintas técnicas para determinar los lípidos totales en sangre:

  • Métodos gravimétricos: consiste en la extracción de los lípidos totales con disolventes orgánicos, evaporación del disolvente y posterior pesada.
  • Métodos colorimétricos (fosfovainillina): se fundamenta en:
    • Los lípidos totales tratados con ácido sulfúrico y posterior acción de la fosfovainillina dan una coloración rosada proporcional a su concentración.
    • Lípidos (muestra) + H2SO4 + Q R + fosfovainillina R compuesto color rosa.
  • Métodos turbidimétricos: se fundamentan en:
    • Lípidos (muestra) + sulfato de dextrano y Mg R precipitan los lípidos.
  • Métodos cromatográficos.

4. INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Podemos clasificar la situación lipémica de un individuo en 2 grupos:

4.1 Normolipemias

El paciente tiene todos los lípidos sanguíneos dentro de los valores normales.

4.2 Dislipemias

Este término se aplica para las alteraciones del metabolismo de los lípidos en general. Para el examen inicial de una posible dislipemia bastará la determinación de lípidos totales, TG y colesterol.

Cuando se hace referencia a las alteraciones de las fracciones lipídicas circulantes, utilizaremos los términos:

  • Hipolipemia: Los lípidos del plasma están disminuidos total o parcialmente. Tiene escaso interés clínico y se presenta inespecíficamente en muchas afecciones carenciales (inanición) y frecuentemente en hipertiroidismo, infecciones agudas, anemias graves.
  • Hiperlipemia: El paciente tiene aumentados todos o algunos de los lípidos plasmáticos (triglicéridos y/o colesterol principalmente). Se presenta en distintas situaciones:
    • Hiperlipemia postprandial o alimenticia.
    • Hiperlipemia del hambre: en sujetos sometidos a ayuno prolongado.
    • Embarazo y durante la lactancia.
    • Diabetes.
    • Hipotiroidismo.
    • Pancreatitis.

Cuando se hace referencia a las alteraciones de las lipoproteínas que los transportan, utilizaremos los términos:

  • Hiperlipoproteinemia: Aumento de lipoproteínas plasmáticas.
  • Hipolipoproteinemia: Disminución de lipoproteínas plasmáticas.
  • Dislipoproteinemia: Aparición en sangre de lipoproteínas de estructura anormal.

Todas las anteriores alteraciones pueden clasificarse al mismo tiempo en:

  • Primarias: Tienen un componente genético y suelen ser hereditarias.
  • Secundarias: Se producen como consecuencia de otra enfermedad o tratamiento farmacológico.

De todos los lípidos presentes en el plasma, el colesterol y los triglicéridos proporcionan datos cuantitativos útiles en el tratamiento clínico de la enfermedad arteriosclerótica.

Niveles elevados de triglicéridos en heces (esteatorrea) aparecen cuando hay una insuficiente digestión o mala absorción intestinal de estos lípidos.

Los ácidos grasos libres o no esterificados pueden ser utilizados como fuente de energía y sus niveles aumentan en plasma en casos de inanición, embarazo y en estados diabéticos mal controlados. En condiciones normales, los ácidos grasos libres representan una cifra pequeña con respecto al total de lípidos existentes en la sangre y son transportados en el plasma en forma de complejo con la albúmina.

Con una frecuencia mucho menor se producen enfermedades por almacenamiento de lípidos -sobre todo esfingolípidos- denominadas lipoidosis, cuyo origen está en un déficit en una enzima relacionada con su metabolismo.

TRIGLICÉRIDOS Y FOSFOLÍPIDOS

1. INTRODUCCIÓN

Los lípidos saponificables -aquellos que contienen ácidos grasos en su molécula- se clasifican en:

  • Simples:
    • Ácidos grasos.
    • Triglicéridos.
    • Ceras.
  • Compuestos:
    • Fosfolípidos.
    • Glucolípidos.

2. ÁCIDOS GRASOS

Los ácidos grasos son ÁCIDOS MONOCARBOXÍLICOS DE CADENA HIDROCARBONADA LARGA.

Su fórmula general es CH3-(CH2)n-COOH y contienen un número par de átomos de carbono y en los cuales n oscila entre 10 y 22.

Los ácidos grasos pueden estar:

  • Libres.
  • Formando parte de la molécula de un lípido saponificable. Normalmente no se encuentran en estado libre, sino que se liberan en la hidrólisis de los lípidos.

La cadena hidrocarbonada puede ser:

2.1 Saturada

  • En la cadena no hay ningún doble enlace y suelen ser sólidos a temperatura ambiente.
  • Su origen es generalmente animal.
  • Los más abundantes son el ácido palmítico (16 átomos de carbono en su molécula) y el esteárico (18 átomos de carbono).

2.2 Insaturada

  • En la cadena hidrocarbonada hay uno o más dobles enlaces.
  • Así podremos hablar de ácidos grasos monoinsaturados (poseen un doble enlace) o poliinsaturados (poseen varios dobles enlaces).
  • Los ácidos grasos insaturados son líquidos a temperatura ambiente y su origen es preferentemente vegetal, con excepción de ciertos pescados ricos en ácidos grasos poliinsaturados.

El ácido oleico (aceite de oliva) es un ácido graso monoinsaturado con 18 carbonos. Entre los poliinsaturados, los más importantes son el ácido linoleico, el linolénico y el araquidónico.

Los ácidos grasos más abundantes en los seres vivos contienen un número par de átomos de carbono, es decir, están formados por una cadena hidrocarbonada que contiene de 14 a 22 átomos de carbono (los más abundantes contienen de 16 a 18 carbonos).

En la mayor parte de los ácidos grasos insaturados hay un doble enlace entre el carbono 9 y el carbono 10 (contando a partir del grupo carboxílico).

Cuando aparecen más dobles enlaces, no se hallan nunca continuos, sino que están separados por un grupo -CH2 (-CH=CH-CH2-CH=CH-).

Los dobles enlaces de casi todas las clases de ácidos grasos insaturados que se encuentran en la naturaleza aparecen en configuración geométrica cis, y hay muy pocos que posean la configuración trans.

Los ÁCIDOS GRASOS TRANS son:

  • Un tipo de ácido graso insaturado.
  • Que se encuentra principalmente en los alimentos industrializados que han sido sometidos a hidrogenación, como la margarina (para solidificarla), o al horneado, como los pasteles (mejora la textura, la frescura y la estabilidad). También se encuentran en pocas cantidades en la leche y la grasa corporal de los rumiantes.

Los ácidos grasos trans:

  • Aumentan la concentración de lipoproteínas de baja densidad (LDL).
  • Disminuyen las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en la sangre, provocando:
    • Un mayor riesgo de enfermedades cardiovasculares.
    • Mayor riesgo de algunos cánceres.
    • Diabetes mellitus tipo II.

Los ÁCIDOS GRASOS ESENCIALES son un grupo de ácidos grasos poliinsaturados que no puede sintetizar el hombre y deben ser ingeridos en la alimentación, ya que los vegetales sí son capaces de sintetizarlos. Son necesarios para el crecimiento y reciben el nombre de vitamina F.

  • Linoleico (origen vegetal).
  • Linolénico (origen vegetal).
  • Araquidónico (no se encuentra en las plantas, sino que se sintetiza a partir del linoleico).

Los ácidos grasos son moléculas ANFIPÁTICAS, que presentan una cabeza polar o hidrófila (grupo carboxílico) y una cola hidrófoba (cadena hidrocarbonada).

Los ácidos grasos en medios acuosos forman MICELAS con los extremos carboxílicos hacia el agua y las colas en el interior de la micela.

También pueden situarse formando una monocapa con las colas expuestas al aire y las cabezas hacia el interior de la fase acuosa o bien formar bicapas en las que las colas se sitúan hacia el interior de la bicapa y las cabezas hacia el exterior.

3. TRIGLICÉRIDOS (Triacilglicéridos)

Los triglicéridos o grasas neutras son los PRINCIPALES LÍPIDOS DE RESERVA en el hombre, constituyendo aproximadamente el 95% de los lípidos presentes en el tejido adiposo. También se encuentran en el plasma, donde forman parte de las lipoproteínas.

Los triglicéridos se forman por ESTERIFICACIÓN entre un ALCOHOL (el glicerol o glicerina) y uno, dos o, más frecuentemente, tres ÁCIDOS GRASOS -ácidos monocarboxílicos de cadena larga, saturada o insaturada- dando origen a monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos, respectivamente.

Si la esterificación se produce con una sola clase de ácido grado, se obtiene un TRIGLICÉRIDO SIMPLE; si los ácidos grasos son diferentes, TRIGLICÉRIDOS MIXTOS. La mayoría de los triglicéridos en humanos son mixtos -glicerol esterificado con tres ácidos grasos diferentes o bien con dos iguales y uno distinto-.

Los triglicéridos pueden ser hidrolizados por:

  • Lipasas de la secreción pancreática.
  • Álcalis (NaOH, KOH). En este caso se produce una reacción de saponificación con la consiguiente formación de jabones (son las sales sódicas o potásicas de los ácidos grasos).

Los triglicéridos se detectan en diversas concentraciones en todas las lipoproteínas del plasma.

En general, cuanto mayor es la concentración de triglicéridos, menor es la densidad de la lipoproteína.

Las principales lipoproteínas portadoras de triglicéridos son los quilomicrones y las VLDL -lipoproteína de muy baja densidad-.

Aproximadamente, cada día se ingieren de 1 a 2 gramos de triglicéridos por kilogramo de peso corporal.

En el interior del intestino, los triglicéridos quedan parcialmente HIDROLIZADOS a mono, diglicéridos y ácidos grasos libres -no esterificados-.

Estas moléculas son absorbidas en forma de MICELAS y vuelven a constituir triglicéridos en la mucosa intestinal.

Los triglicéridos de nueva formación se incorporan entonces a los quilomicrones, aunque también se forman pequeñas cantidades de VLDL.

Los quilomicrones, ricos en TRIGLICÉRIDOS EXÓGENOS, pasan al interior de los capilares linfáticos situados en las vellosidades del intestino delgado y son transportados a la circulación sanguínea a través del conducto torácico, para su distribución a la mayoría de los tejidos sin pasar por el hígado.

Algunas moléculas de glicerol y ácidos grasos de cadena corta pasan al hígado a través de la vena porta junto con aminoácidos y monosacáridos.

Los TRIGLICÉRIDOS ENDÓGENOS, originados en el hígado, constituyen la principal fuente de triglicéridos plasmáticos en ayunas. Se sintetizan a partir de:

  • Los ácidos grasos libres captados por el hígado.
  • El acetil-coenzima A procedente del metabolismo de los hidratos de carbono.

Estos triglicéridos son liberados del hígado en forma de VLDL. Una pequeña cantidad de triglicéridos endógenos es transportada en la HDL y LDL.

3.1 MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

La mayoría de los métodos utilizados actualmente se basan en la cuantificación del contenido en GLICEROL de los triglicéridos previa hidrólisis de los triglicéridos en glicerol y ácidos grasos libres. Estos métodos se dividen en MÉTODOS QUÍMICOS y MÉTODOS ENZIMÁTICOS.

Los MÉTODOS QUÍMICOS consisten en:

  • La extracción y aislamiento de los triglicéridos con posterior.
  • Hidrólisis de los mismos a glicerol y ácidos grasos.

El glicerol producido es OXIDADO con producción de formaldehído, el cual puede ser determinado por diversos procedimientos. Otros métodos pueden determinar triglicéridos intactos en el plasma sin hidrólisis anterior.

En estos métodos existen muchísimas interferencias de todo tipo, a parte de ser costosos de tiempo, por lo que habitualmente se emplean los métodos enzimáticos.

Los MÉTODOS ENZIMÁTICOS utilizan diversos sistemas para hidrolizar los triglicéridos de las muestras.

Los más utilizados emplean una TRIGLICÉRIDO-LIPASA de origen microbiano con producción de GLICEROL LIBRE y posterior determinación del mismo mediante sistemas enzimáticos acoplados.

Es conveniente utilizar blancos de glicerol (ya que no hay un aislamiento previo de los triglicéridos), sobre todo cuando queremos aplicar fórmulas como la de Friedewald para la estimación de LDL-col.

Alta especificidad. La mayoría de estos métodos se basan en la hidrólisis enzimática de los triglicéridos por una lipasa bacteriana.

1º. Hidrólisis de los triglicéridos.

2º. El GLICEROL se puede determinar de tres formas:

  1. Medir la cantidad de H2O2 formada.
  2. Medir NAD+ o NADH (Método de Bucolo y David).
  3. Medir variaciones de la absorbancia a 340 nm.

3.2 CONDICIONES DE LA MUESTRA

Las determinaciones de lípidos están sujetas a múltiples variaciones y, para minimizarlas y obtener resultados óptimos, deben seguirse una serie de normas:

  • Los triglicéridos, así como el colesterol y otros lípidos, pueden medirse tanto en el PLASMA como en el SUERO, aunque las concentraciones de estos lípidos en el plasma tratado con EDTA resultan aproximadamente un 3% más bajas que en el suero.
  • Cuando se utiliza plasma, el mejor anticoagulante es el EDTA debido a su efecto estabilizador sobre las lipoproteínas.
  • Para evitar cualquier variación después de la recogida de las muestras, la sangre debe enfriarse a 4 °C y separar las células en cuanto sea posible. Si solo se van a analizar los triglicéridos o el colesterol, o ambos, el plasma o el suero pueden congelarse. La muestra no puede congelarse si en la misma hay que determinar lipoproteínas.
  • Se debe también estandarizar la posición, por ej., dejar sentado al enfermo durante 30′, ya que la posición modifica el volumen de plasma en circulación.
  • Evitar la hemólisis, pues interfiere en la determinación.
  • Ayuno durante 12-14 horas, pues algunos alimentos tienen un efecto ligero sobre los niveles de colesterol y de TG en plasma y, además, los quilomicrones han sido aclarados del plasma.
  • Tener un peso constante más o menos durante 2 semanas.
  • Evitar tomar fármacos que interfieran en la determinación de los lípidos al menos un mes antes de la toma de muestra. Los contraceptivos orales aumentan los niveles de TG y de colesterol; la terapéutica de reposición de estrógenos disminuyen los niveles de colesterol.
  • Retrasar la extracción hasta tres meses cuando se haya sufrido un infarto de miocardio o una operación importante.
  • Restringir o eliminar el consumo de alcohol desde 2 días antes.