Microorganismos y Técnicas de Cultivo

Clasificación de Microorganismos por Fuente de Energía

Los microorganismos que obtienen su fuente de energía y carbono de compuestos orgánicos se denominan quimioorganótrofos. Obtienen la energía de la oxidación de moléculas orgánicas que también les sirven como fuente de carbono.

Aerobios y Anaerobios

  • Aerotolerantes: Son microorganismos que crecen bien tanto en presencia como en ausencia de oxígeno.

Microscopía

Parámetros de la Microscopía:

  • Enfoque/Ampliación o aumentos
  • Resolución
  • Contraste

Ajustes del Microscopio:

  • Intensidad de la luz
  • Posición del condensador
  • Apertura del diafragma

Técnicas de Tinción:

  • Tinción simple: Se realiza sobre un frotis, donde los microorganismos se adhieren al portaobjetos mediante la llama de un mechero, que los fija y desnaturaliza.
  • Tinción negativa: Se emplean colorantes aniónicos o ácidos, que tiñen el fondo y dejan sin teñir los microorganismos.
  • Tinción diferencial: Se emplean dos colorantes. Según el tipo de microorganismo, este se tiñe de un color u otro. En este caso, lo que se tiñe es el propio microorganismo.

Desinfección y Esterilización

Desinfección: Elimina solo los microorganismos patógenos.

Esterilización: Elimina todos los microorganismos.

Capacidad de Infección y Contaminación

Capacidad de infección: Es la capacidad de un microorganismo para crecer o multiplicarse dentro del organismo humano.

Capacidad de contaminación: Es la capacidad de un microorganismo para contaminar un ambiente o superficie.

Crecimiento Microbiano

Factores que Afectan el Crecimiento Microbiano

  • Temperatura de incubación
  • Composición de la atmósfera de incubación (suministro de O2)
  • Tiempo de incubación
  • Luz
  • Humedad (%)

Vías Metabólicas

Vía oxidativa: El aceptor final de electrones es el oxígeno. El proceso es aerobio y produce poca acidez.

Vías metabólicas fermentativas: El aceptor final de electrones es un compuesto orgánico. El proceso es anaerobio y origina mucha acidez en poco tiempo.

Fases del Crecimiento Microbiano

  1. Fase de latencia: Zona donde los microorganismos crecen muy lentamente. Deben acumular los factores de arranque y de crecimiento para empezar a crecer a un ritmo normal.
  2. Fase exponencial: Zona donde hay un crecimiento exponencial, es decir, crecen de forma lineal.
  3. Fase estacionaria: Se acaban los nutrientes y empieza a disminuir el ritmo de crecimiento. Muere la misma cantidad de microorganismos que crecen.
  4. Fase de muerte: Agotamiento total de los nutrientes y toxicidad del medio.

Crecimiento en Presencia y Ausencia de Oxígeno

Si un microorganismo crece tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, se observaría crecimiento en todo el tubo de cultivo, ya que el oxígeno no les daña.

Cultivos Celulares

Características de los Cultivos Celulares

El contacto entre las células hace que ellas mismas inhiban su crecimiento. Por otro lado, las células presentan propiedades morfológicas y fisiológicas similares a las que mostrarían en el tejido vivo de procedencia.

Tipos de Células Vegetales en Cultivo

  • Células totipotentes: Están presentes en los distintos órganos de una planta y pueden diferenciarse para generar tejidos nuevos e incluso un individuo completo.

Tipos de Meristemas:

  • Meristemas primarios o apicales
  • Meristemas secundarios, laterales o auxiliares
  • Meristemas adventicios

Tipos de Cultivos Celulares

Cultivos en suspensión: Las células se encuentran dispersas en el medio de cultivo y su crecimiento no está supeditado a ningún anclaje sobre el material soporte (células madre, células tumorales).

Cultivos en monocapa: Las células crecen adheridas sobre un soporte sólido formando una capa de células de espesor.

Obtención de Protoplastos

Los protoplastos son células vegetales sin pared celular desagregadas unas de otras. Se obtienen mediante la disgregación celular a partir de callos formados a partir del cultivo de explante.

Líneas Celulares

Son el resultado de un cambio genotípico denominado transformación.

Características de las Líneas Celulares:

  • Son inmortales: crecen indefinidamente.
  • Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibición por contacto, la limitación de la densidad celular durante la proliferación y la dependencia del anclaje.
  • Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores.
  • Son genéticamente inestables: son heteroploides y presentan aberraciones cromosómicas.

Formación de Callos y Rediferenciación

El callo corresponde a un crecimiento celular normalmente de la zona de la periferia del tejido en contacto con el medio de cultivo. Posteriormente, cultivando el callo en condiciones adecuadas, se puede inducir una rediferenciación celular a partir de la cual se desarrollan órganos de plantas o bien embriones somáticos.

Importancia del Oxígeno y CO2 en Cultivos

El oxígeno en la atmósfera es necesario durante todo el cultivo para la oxidación de la glucosa, que provee de energía y carbono a la célula. La concentración de CO2 resulta muy importante para el mantenimiento del pH del cultivo a través del sistema tampón bicarbonato-CO2.

Transformación de Plantas con Agrobacterium

La bacteria Agrobacterium tumefaciens se transforma previamente con el gen de interés soportado en un plásmido de tipo Ti. Después, se cultivan conjuntamente las células de Agrobacterium y de la especie vegetal a transformar. Se aprovecha la capacidad del Agrobacterium para infectar a las células transfiriéndoles el gen de interés. Las células infectadas proliferarán hasta generar una nueva planta que será capaz de expresar el gen de interés con el que han sido transformadas.

Fusión de Protoplastos

Se emplean disoluciones enzimáticas para la maceración de los tejidos de la planta original.

Ventajas de la Fusión de Protoplastos:

  • La posibilidad de ser transformados con ADN exógeno con relativa facilidad.
  • La fusión de protoplastos origina células vegetales con carga genética diferente a las células iniciales.

Biotecnología y ADN Recombinante

La biotecnología permite obtener ADN recombinante cortando y ligando fragmentos de un ADN vector o portador con un gen procedente de un ADN donante. Posteriormente, dicho ADN recombinante se introduce en el interior de una bacteria, aumentando su genoma o dotación genética, paso que se denomina transformación.

Biorreactores y Procesos de Cultivo a Gran Escala

Cultivos Continuos y Semicontinuos

Permiten obtener lotes o cosechas sucesivas con una tasa de crecimiento elevada, evitando la fase de latencia. Las células se encuentran en la fase de crecimiento o exponencial, por lo que se reducen los tiempos de latencia (lag). Se diferencian en los periodos de tiempo: el semicontinuo es más corto que el continuo.

Desventajas de los Cultivos Continuos:

  • Posible contaminación durante los procesos de alimentación y purga.
  • Mutaciones celulares por sobreuso de la misma cepa durante largos periodos de tiempo.

Homogeneización para Rotura Celular

Un homogeneizador es un método mecánico para la rotura celular. Los homogeneizadores emplean bombas de alta presión que fuerzan al cultivo del bioproceso a través de un orificio de dimensiones regulables, aplicando presiones superiores a 500 atm. La rotura se produce en la válvula de cavitación y en el choque contra el anillo de impacto.

Upstream y Downstream en Bioprocesos

Upstream:

  • Selección, diseño e ingeniería molecular de las especies o cepas, así como la modificación de los sistemas de expresión genética de la célula.
  • Mejora de la especie o cepa, o modificación genética.
  • Preparación de medios y de materias primas.
  • Escalado del biorreactor.

Downstream: Es la parte más determinante porque incluye la purificación del producto y el tratamiento de los residuos de la biorreacción o fermentación.

Enzimas de Restricción

Las enzimas de restricción reconocen secuencias cortas concretas en la doble hélice del ADN. Cortan de una manera fija en cada caso la cadena de ADN. Son endonucleasas.

Cinética de Crecimiento Microbiano

Habitualmente, la evolución de la constante de la velocidad de crecimiento o de la cinética de crecimiento suele mostrar un comportamiento que se adapta a la Ecuación de Monod.

Procesos de Separación y Purificación

Disrupción celular: En los casos en que los productos de interés están en el interior de las células, se lleva a cabo el proceso de ruptura celular, empleando técnicas como la homogeneización, el molino de bolas o el choque osmótico.

Auxiliares de filtración: En los procesos de filtración de bioprocesos se pueden usar auxiliares de filtrado, como tierra de diatomeas, que mejoran la eficiencia de la filtración.

Tipos de Filtración con Membranas:

  • Microfiltración: Para partículas de 0,02 a 10 μm, recuperación de biomasa cercana al 100%.
  • Ultrafiltración: Para partículas de 3 a 100 nm.
  • Diafiltración: Para lavar y dializar las sales con agua limpia.