Mejora de Cepas Microbianas Mediante Mutagénesis
El número de mutantes con aumento de rendimiento depende de:
- La cepa
- Las condiciones de mutagénesis
- La vía de biosíntesis
- La regulación del producto que está siendo optimizado.
Mutaciones Puntuales
Las mutaciones puntuales se utilizan para mejorar cepas microbianas. Estas mutaciones se pueden revertir.
Tipos de Mutaciones Puntuales
- Sustitución de un nucleótido por otro.
- Corrimiento del marco de lectura.
- Inserciones.
- Deleciones.
Revertante o Revertante
Una cepa revertante es aquella que restaura el fenotipo de la cepa silvestre.
Tipos de Revertantes
- De un mismo sitio: cuando la mutación que restaura la actividad ocurre en el mismo sitio donde ocurrió la mutación original.
- De segundo sitio: cuando la mutación que restaura la actividad ocurre en un sitio diferente del DNA.
Mutágenos
Mutágenos Químicos
Análogos de bases:
- 5-Bromouracilo por timina
- 2-Aminopurina en lugar de adenina.
Agentes que reaccionan con el DNA:
- Ácido nitroso (HNO2).
- Hidroxilamina (NH2OH).
- Agentes alquilantes: etil metano sulfonato (EMS), metil metano sulfonato (MMS), dietil sulfato (DES), diepoxi butano (DEB), N-metil-N-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), N-metil-N-nitroso urea y gas mostaza.
Agentes intercalantes:
Acridinas y bromuro de etidio, se insertan entre dos pares de bases del DNA.
Radiaciones
Luz Ultravioleta
- Entre 200 – 300 nm con absorción máxima a 254 nm. Produce la formación de dímeros de pirimidinas adyacentes: (timina-timina; timina-citosina; citosina-citosina).
- Dosis usual: radiación que produzca 90% – 95% de muerte en la población.
- En presencia de luz, hasta el 80% de los dímeros de timina que existen en el genoma pueden ser fotorreactivados.
- La frecuencia de mutación se incrementa evitando los mecanismos de fotorreactivación.
Radiación Ionizante
Rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma. Causan indirectamente efectos mutagénicos debido a la ionización del agua y de otras sustancias.
Biorreactores
Agitadores
- Tipo Turbina: Presentan un patrón de flujo radial. Pueden presentar un disco donde tienen acoplado unas hojas y pueden variar en número y tamaño.
- Aplicación:
- Líquidos poco viscosos, usar tipo Rushton de paleta plana.
- Cuando la viscosidad aumenta, usar tipo ancla.
- Para reducir el tiempo de mezcla de líquidos con viscosidad elevada, tipo spin.
- Para microorganismos frágiles, tipo paleta encorvadas.
- Aplicación:
- Tipo Hélice: Presentan patrón de flujo axial. Presentan en sus extremos paletas truncadas por una hélice y pequeñas paletas de hélice de paso invertido. El flujo circula de arriba hacia abajo.
- Eficaces para tanques de gran tamaño.
- Opera con velocidad elevada.
- Los agitadores de hélice más pequeños giran a 1.150 ó 1.750 rpm.
- Los mayores giran de 400 a 800 rpm.
- Aplicación:
- Para fluidos viscosos (hélice de paletas grandes).
Elección del Tipo de Impulsor
- Definición de características geométricas.
- Designar longitud de las contra paletas o BUFLES, para evitar fenómeno de vórtice.
- Establecer la potencia absorbida por el líquido.
- Establecer si son sistemas con fluidos Newtonianos no aireados o fluidos Newtonianos aireados.
Fluidos Newtonianos No Aireados
Número de Newton (o de potencia): Np
Np = Fuerza aplicada/fuerza de la inercia
Relaciona la energía requerida por los reactores agitados
Np = Po/N3.Di5. d
- N = Velocidad de agitación
- Ρo = fuerza de agitación
- Di = diámetro del agitador
- d = densidad del medio
Número de Reynolds
Determina el flujo que se tiene que dar dentro del reactor (velocidad de flujo). Relaciona las fuerzas de inercia y viscosidad.
NRe = Re = Dia2. N. d/n
- Di = diámetro del agitador (cm)
- N = velocidad del agitador (seg-1)
- d = densidad
- n = viscosidad dinámica
Fluidos Newtonianos Aireados
Cuando se aplica aire a un sistema la potencia baja, el aire absorbe energía.
Existe la relación: Pg/P = Na
- Pg = potencia que se consume por agitación en presencia de gas
- P = potencia sin gas.
- Na = agitación definida.
A mayor aireación mayor potencia requerida para generar aire y menor para agitación.
LOOP..dia.trab/alt.trab=1/4*dia.tubo.draft/diam.trab=1/3,*alt.tubo.dra./alt.trab=2/3.*Holdup/alt.trab.=1/5.*alt.filtro./alt.frasco=2/3……
-AGITADO.-diam.impul/diam.tank=1/3.*long d bafle/diam impul=1/4.*alt d placa/diam impu=1/5.*alt d reacto/diame impul=1.*ancho d bafle/diam tanque=1/10.
Rol del O2
- Como receptor final de electrones y de los protones producidos en las reacciones de oxidación.
- Como inductor o represor de la síntesis de enzimas respiratorias (forma directa).
- En forma indirecta, en el metabolismo energético.
- La demanda de O2 depende del crecimiento del microorganismo y producción de metabolitos.
- La transferencia de masa de O2 se simboliza Na (Na = KL a (C* – CL) = Ot R)
- Na = transferencia de O2 dependiente de volumen
- KL = coeficiente de transferencia en la interfase.
- a = superficie específica de intercambio.
- C* = valor de saturación de gas disuelto en la interfase.
- CL = concentración de gas disuelto.
- KLa = coeficiente volumétrico de transferencia de O2.(Na) Es el parámetro crítico para el funcionamiento del reactor.
Depende de:
- Del Biorreactor: diámetro, capacidad, potencia, sistema de aireación y velocidad de aireación.
- De la solución: nutrientes, microorganismos, agentes antiespumantes y la Tº.
- Las sustancias antiespumantes reducen el valor de KLa.
- Los microorganismos tienen un efecto sobre la transferencia actuando como barreras.
- El valor de KLa desciende a medida que aumenta el tamaño de los pellets.
- En ausencia de microorganismos la transferencia de O2 se detiene, entonces el medio está saturado.
- En el reactor con inóculo, la concentración de O2 disuelto en el medio disminuye. Máxima transferencia de O2 se logra cuando CL es igual a cero.
- Cuando CL disminuye cerca de la concentración crítica de O2, el crecimiento microbiano se hace lento.
Las Fermentaciones Deben Ser Llevadas a Cabo:
- Un margen estrecho de temperatura o constante.
- Por la agitación y a la actividad metabólica se debe recurrir a sistemas de refrigeración (camisas de agua).