Sistema de Dos Híbridos en Levaduras

Este método aprovecha la flexibilidad de las estructuras activadoras para identificar genes cuyos productos se unen a proteínas específicas de interés. Emplea un vector de levadura para expresar un dominio de unión al ADN y una región conectora flexible sin el dominio de activación asociado, como el gen GAL-4. Una secuencia de ADNc que codifica una proteína o un dominio proteico de interés (dominio C) se fusiona en marco a la región conectora flexible, de manera tal que el vector expresa una proteína híbrida compuesta por el dominio de unión al ADN, la región conectora y el dominio C.

Una genoteca de ADNc es clonada para formar múltiples copias de un segundo vector de levaduras que codifica un dominio de activación fuerte y un conector flexible, para producir una genoteca de vectores que expresan múltiples proteínas híbridas, cada uno con un dominio P distinto. El vector C y la genoteca de vectores P se transportan a células de levaduras diseñadas genéticamente donde la interacción de las dos proteínas híbridas C y P, en el núcleo de la célula, producen un aumento de la transcripción de un gen reportero necesario para la síntesis de algún aminoácido (como la histidina).

Etiquetado de Afinidad de Isótopos Codificados (ICAT)

Técnica aplicada al estudio del perfil de expresión diferencial de proteínas entre dos muestras proteicas (proteómica de expresión). Las dos muestras son marcadas con el reactivo de ICAT ligero o pesado (hidrógeno o deuterio): difieren en la masa (8 Da) debido a la composición de isótopos. El reactivo ICAT se une a las cisteínas mediante un grupo tiol y contiene biotina para facilitar la purificación mediante cromatografía de afinidad.

Posteriormente, las dos muestras marcadas se mezclan y se digieren con tripsina. Se separan los péptidos marcados con ICAT en una columna de afinidad y se analizan mediante espectrometría de masas (MS). La intensidad relativa de los péptidos de cada muestra indica la abundancia de la proteína en las muestras. La fragmentación del péptido mediante MS/MS permite determinar la secuencia de aminoácidos y conduce a la identificación de la proteína.

Ventajas del ICAT

  • Permite realizar en el mismo análisis:
  • Identificación de las proteínas.
  • Comparación de los niveles de expresión.
  • Eliminación de la electroforesis bidimensional (2D-PAGE) para cuantificar las proteínas.

Problemas del ICAT

  • Utiliza proteínas que contienen cisteína (presente en la mayor parte de proteínas).
  • Baja sensibilidad para proteínas poco abundantes.

Geles Bidimensionales (Electroforesis Bidimensional)

Técnica para separar, identificar y medir las proteínas de una muestra. La separación se basa en las cargas de las moléculas. En la primera dimensión, las proteínas se separan según sus puntos isoeléctricos, esto significa que migran en el gradiente de pH hasta que la carga neta de una proteína dada sea igual a cero. En la segunda dimensión, las proteínas se desnaturalizan de tal manera que cada resto de aminoácidos da una carga fija. Las proteínas se separan entonces por tamaño (electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico, SDS-PAGE).

Antes de empezar la electroforesis, las células se ponen a crecer en cada una de las condiciones (condición A, condición B). Ambas condiciones se corren en geles diferentes. Después, las muestras se tiñen, se revelan y se comparan las manchas en un ordenador. Luego se recorta el sitio de interés y se realiza una espectrometría de masas. Esta técnica para el análisis de proteínas o péptidos requiere un método para la ionización de las muestras y puede ser dividido en dos categorías generales:

  1. Análisis de péptidos: Las masas de los péptidos individuales en una muestra son medidos y usados para crear un espectro de masas. Estas masas experimentales son comparadas con masas teóricas de proteínas presentes en bases de datos.
  2. Análisis de aminoácidos: Conocido como técnica MS/MS, es usada para fragmentar un péptido en péptidos más pequeños para deducir la secuencia de aminoácidos que se comparan con secciones de aminoácidos de bases de datos.

Radiación

Consiste en la propagación de energía en forma de ondas electromagnéticas o partículas subatómicas a través del vacío o de un medio material.

Espectroscopia

Estudio de la interacción entre la materia y la radiación en función de la longitud de onda.

Radiación Sincrotrón

Radiación electromagnética generada por partículas cargadas que se mueven según una trayectoria curva a alta velocidad en un campo magnético. La emisión sincrotrón se produce artificialmente en los anillos de almacenamiento de un sincrotrón. En la naturaleza, se produce por los electrones a muy altas velocidades moviéndose a través de los campos magnéticos del espacio y se observa en las explosiones y en remanentes de supernovas, radiogalaxias y púlsares.

Angiogénesis

Proceso fisiológico que consiste en la formación de vasos sanguíneos nuevos a partir de los vasos preexistentes. Es un proceso normal durante el desarrollo embrionario, crecimiento del organismo y en la cicatrización de las heridas.