Marcadores de Segundo Trimestre

Estriol No Conjugado (uE3)

Es un marcador de segundo trimestre de origen feto-placentario. En gestaciones no complicadas, la concentración de estriol total y no conjugado aumenta a lo largo del embarazo. El uE3 representa aproximadamente el 9 % de todas las formas de estriol presentes en el suero materno y refleja mejor la producción fetoplacentaria de estriol. Se ha observado una concentración disminuida en el suero materno de uE3 en embarazos afectos con síndrome de Down, síndrome de Edwards y con el síndrome de Smith-Lemli-Opitz (SLOS)¹ y en la deficiencia de sulfatasa esteroidea.

¹ Está causado por una mutación en el gen DHCR7 localizado en el cromosoma 11 humano (11q13.4), lo cual provoca deficiencia en la enzima 7-dehidrocolesterol reductasa que está implicada en la síntesis del colesterol y convierte el 7-dehidrocolesterol en colesterol.

Alfa-Fetoproteína Sérica Materna

Para el riesgo de DEFECTOS DEL TUBO NEURAL (DTN) como anencefalia o espina bífida, se realiza en el segundo trimestre (16-18 semanas de gestación) la determinación de niveles de α-fetoproteína sérica materna (AFP). Es necesario conocer la edad gestacional y corregir el riesgo según el peso materno, la raza o si padece diabetes mellitus. Permite detectar el 80% de las espinas bífidas y el 90% de la anencefalias.

Inhibina-A

Las inhibinas son hormonas proteicas secretadas por células de la granulosa del ovario y la placenta en la mujer y por las células de Sertoli de los testículos del hombre. La molécula completa consta de una subunidad α unida a una subunidad βA (inhibina-A) o a βB (inhibina B) por un puente disulfuro. La concentración de inhibina-A en el suero materno se eleva durante el primer trimestre y después disminuye aproximadamente a las 10 semanas. La concentración permanece estable entre las 15 – 20 semanas de gestación. Se ha encontrado una concentración de Inhibina A más elevada en el segundo trimestre del embarazo de fetos afectos de Síndrome de Down, así como en otras aneuploidías como la trisomía 18, que la observada en embarazos euploides.

Amniocentesis

La amniocentesis se realiza entre las semanas 15 a 17 de la gestación y consiste en la obtención de 20 a 30 mL de líquido amniótico mediante una punción abdominal inmediatamente antes de la cual se realiza una ecografía a tiempo real que permite valorar la posición de la placenta, la localización del líquido amniótico y el feto. El líquido amniótico obtenido contiene células de origen fetal que provienen de piel, riñones, tracto respiratorio y gastrointestinal, pared de amnios…

Indicaciones para la Amniocentesis

Teniendo en cuenta que hay riesgo de aborto, las indicaciones son las siguientes:

  • Anomalías cromosómicas en hijos anteriores.
  • Padres portadores de anomalías cromosómicas compensadas, fenotípicamente normales, como translocaciones -robertsonianas¹ o recíprocas-, y las inversiones -paracéntricas² o pericéntricas- o con alteraciones cromosómicas como trisomias (un tercio de los descendientes de una madre con trisomia de par 21 son trisómicos; los hombres con trisomia del par 21 son estériles) mosaicos, aneuploidia…
  • Edad materna avanzada (> 35 años): las anomalías cromosómicas pueden aparecer en hijos de madres de cualquier edad, pero la frecuencia de niños trisómicos se eleva con la edad y de forma exponencial a partir de los 35 años.
  • Parejas portadoras de alguna enfermedad hereditaria o cuando ambos progenitores se identifican como portadores de mismo gen anormal autonómico recesivo (ya han tenido algún hijo afectado o han sido diagnosticados en un programa de screening para heterocigotos) y la enfermedad puede detectarse en periodo prenatal como enfermedades por depósito de glucógeno, alteraciones del metabolismo lipídico, fibrosis quística…
  • Hijos anteriores con defectos en el cierre del tubo neural (espina bífida o anencefalia) que se heredan como trastornos poligénicos/multifactoriales, siendo el riesgo de que hijos posteriores lo padezcan de un 1-2%.

Cariotipo

Cultivo de la Muestra

Las células de la muestra se depositan en un medio adecuado para su cultivo al que se añade fitohemaglutinina (agente mitógeno) y se incuba a 37º C durante 48-72 horas.

Obtención de Cromosomas en Metafase

Se añade colchicina al medio de cultivo con lo cual se detiene la mitosis en metafase (cuando mejor se aprecian los cromosomas); se rompen las membranas celulares mediante la adición de un líquido hipotónico. Se fijan los cromosomas mediante una mezcla de ácido acético glacial y metanol 1:3.

Realización de las Preparaciones

Se realiza una extensión de la muestra procesada sobre un portaobjetos; se deja secar al aire y se tiñe (Giemsa) y se observa a microscopio. Se deben analizar 25 metafases elegidas al azar.

Bandeo Cromosómico

La tinción convencional de los cromosomas con GIEMSA produce una coloración uniforme que no permite apreciar detalladamente su morfología. Actualmente se han desarrollado tinciones que tiñen selectivamente zonas del cromosoma originando la formación de BANDAS cuyo número y posición son características de cada cromosoma:

  • Bandas G (Tripsina/Giemsa): Es el método más frecuente de tinción para colorear los cromosomas originando bandas G pálidas/bandas G oscuras, ricas en GC/ricas en AT, muchos genes/pocos genes, replicación temprana/replicación tardía. Tiene una resolución de 400 bandas.

Cariotipo masculino normal con resolución de 550 bandas. Los pares de cromosomas homólogos se han dispuesto de acuerdo con su: * TAMAÑO, * PATRÓN DE BANDAS y * POSICIÓN DEL CENTRÓMERO. Cada cromosoma puede así compararse banda por banda con su homólogo en busca de cualquier cambio que haya podido tener lugar en la estructura del cromosoma. Este cariotipo se escribe como 46,XY.

Técnicas Citogenéticas Moleculares

Muchas enfermedades son debidas a alteraciones a nivel de un gen no siendo detectadas por estudios cromosómicos como el cariotipo. El desarrollo de la genética molecular ha permitido identificar las bases moleculares de algunas de estas enfermedades genéticas, la mayoría de ellas con un pronóstico incierto.

Las técnicas de biología molecular se utilizan en:

  • a) el diagnóstico de patologías de causa genética en las cuales el gen causante es conocido.
  • b) Igualmente, su utilidad se amplía al diagnóstico de enfermedades infecciosas cuyo agente causante es difícil de cultivar y aislar o
  • c) Enfermedades cuyo diagnóstico se produce cuando la enfermedad se encuentra muy evolucionada.

Estas técnicas presentan ventajas respecto a otras técnicas analíticas:

  • Necesitan cantidades pequeñas de muestra.
  • Detectan cantidades de ácidos nucléicos muy pequeñas (nanogramos).
  • Alta especificidad.

Hibridación de Ácidos Nucleicos

Las TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN se basan en la capacidad que tienen dos cadenas de ácidos nucleicos de reconocerse y unirse específicamente entre ellas si existe un número suficiente de pares de bases complementarias. Según el grado de homología (cantidad relativa de pares de bases complementarias) las dos cadenas de ácidos nucleicos estarán más o menos unidas y si estas dos cadenas carecen de complementariedad, permanecerán separadas (disociadas o desnaturalizadas). La HIBRIDACIÓN de una cadena de un ácido nucleico consiste en la unión de una cadena de ácido desoxirribonucleico o ácido ribonucleico marcada –SONDA DE HIBRIDACIÓN-, a su correspondiente cadena de ácido nucleico complementaria procedente de una muestra biológica –SECUENCIA DIANA-. La unión que mantiene la hibridación son los puentes de hidrógeno que se establecen entre bases de las dos cadenas pudiendo afectar a estas uniones las condiciones de temperatura, pH … Para el desarrollo de las técnicas de hibridación son necesarios: 1) el ácido nucleico procedente de la muestra biológica, 2) la sonda de hibridación y 3) las endonucleasas de restricción.

Sondas de Hibridación

Son fragmentos de ácidos nucleicos monocatenarios marcados. Están constituidos por nucleótidos – formados por una base nitrogenada, una pentosa que, en el caso del RNA es una ribosa y en el ADN una desoxirribosa y una molécula de ácido fosfórico- en un número que oscila entre 15 y 100 siendo sintetizados en el laboratorio de tal forma que su secuencia de bases es complementaria a la de la cadena del ácido nucleico diana. El sistema de marcaje de la sonda (molécula reporter) condiciona el modo de detección y lectura de resultados. Podemos utilizar sondas de varios tipos:

  • Sondas centroméricas
  • Sondas de pintado cromosómico
  • Sondas de secuencia única o locus específicos

Sondas Centroméricas

Están formadas por una secuencia de ADN que hibrida con el ADN de la región centromérica del cromosoma. Permiten detectar alteraciones cromosómicas numéricas en núcleos tanto en metafase como en interfase.

Sondas de Pintado Cromosómico

Formadas por una batería de sondas que, en su conjunto, hibridan con todo el cromosoma. Permite identificar anomalías numéricas y estructurales en núcleos en metafase y confirmar de forma inequívoca cariotipos con translocaciones complejas o con cromosomas marcadores. Es útil cuando los cromosomas son de mala calidad y la citogenética convencional no es suficiente.

Sondas de Secuencia Única o Locus Específicos

Hibridan con una zona de ADN concreta (un gen o banda cromosómica) en núcleos en metafase. Permite identificar alteraciones numéricas y estructurales tanto en metafases o como en núcleos interfásicos. Son de gran utilidad para descartar alteraciones cromosómicas difíciles de identificar con técnicas de bandeo cromosómico convencional como translocaciones cripticas o microdelecciones.

Técnica de Southern Blot (EM Souther 1.975)

Mediante esta técnica podemos visualizar fragmentos de ADN obtenidos mediante endonucleasas de restricción e hibridados con sondas marcadas.

  • Separación de los fragmentos de ADN mediante electroforesis en gel de agarosa/poliacrilamida. Los fragmentos de ADN migrarán hacia el polo positivo -poseen carga negativa debido a sus grupos fosfato- en función de su tamaño. Permite separar fragmentos de ADN que difieren en un solo nucleótido.
  • Desnaturalización. Se procede a la separación de las dos cadenas del ácido desoxirribonucleico y se obtienen fragmentos monocatenarios. La desnaturalización se produce al tratar el gel con una solución alcalina de hidróxido sódico.
  • Transferencia (blotting) a un filtro (nylon o nitrocelulosa). La transferencia se realiza desde el gel por capilaridad o por aplicación de un campo eléctrico. Posteriormente se fija calentando a 80ºC o con radiación ultravioleta.
  • Hibridación con sonda: Debe realizarse en la cámara de hibridación ya que son necesarias condiciones adecuadas de temperatura (42ºC), pH, humedad y concentración de sales. Se coloca el filtro en la cámara de hibridación y se añade la sonda marcada; se produce la unión de la secuencia diana con la sonda de hibridación complementaria mediante la formación de puentes de hidrogeno entre los pares de bases C-G y A-T. Mediante lavado se elimina la sonda que no ha hibridado.
  • Revelado y lectura de resultados. Se pretende la detección de la presencia de la sonda-secuencia diana. La técnica a utilizar depende del marcador de la sonda: Isótopos radiactivos o Fluorocromos. Observación directa a través del microscopio donde se pueden observar zonas fluorescentes debidas a la sonda marcada.

Técnica de Northern Blot

En esta técnica la molécula que se quiere identificar son cadenas de ARN. La diferencia al realizar la técnica radica en que no es necesario desnaturalizar ya que es un ácido nucleico monocatenario. El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables, se separa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado y el resto del proceso es semejante a la hibridación de tipo Southern. El Northern Blot se utiliza frecuentemente para realizar estudios de expresión génica, para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero.

Técnica de Western Blot

Es un procedimiento inmunoelectroforético para la identificación de anticuerpos contra proteínas víricas específicas separadas en función de sus pesos moleculares. En este método, se transfieren las proteínas víricas separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida a una hoja de nitrocelulosa seguido de la detección de las proteínas mediante incubación con un suero problema que puede contener anticuerpos específicos. Si se produce la reacción Ag-Ac aparecen bandas discretas en la tira y tras la eliminación de los anticuerpos que no han participado en la reacción mediante aspirado y/o lavado de la tira, se incuba con Ac anti-IgG humana unido a un enzima que actúa como una sonda. Se aspiran los anticuerpos sobrantes y se añade una solución de sustrato. La reacción se termina mediante lavado y visualización de las bandas. Esta técnica se empezó a utilizar para confirmar el diagnóstico del SIDA identificando la presencia de anticuerpos antiVIH contra cada una de las proteínas virales. Primero se investigan los anticuerpos totales mediante la técnica ELISA -es una técnica muy sensible y específica, pero produce algunos falsos positivos-. Cuando el resultado es positivo, el ELISA se debe repetir en la misma muestra y si es positivo por segunda vez se debe realizar una prueba más específica, por ejemplo el Westhern Blot.

Técnicas de Hibridación In Situ

En la hibridación in situ: – no es necesaria la destrucción de la célula (muestra problema) para obtener la secuencia diana sino que -la sonda de hibridación se une a ella en su interior es decir, se realiza la hibridación de la sonda directamente sobre el tejido con lo que podemos visualizar directamente el segmento de ADN que intentamos localizar en el propio núcleo donde forma híbridos estables.

FISH

FISH es una técnica de hibridación in situ que utiliza sondas de DNA marcadas con un fluorócromo que se une a secuencias diana conocidas del ADN dentro del cromosoma para detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que no pueden detectarse mediante técnicas citogenéticas.

Etapas de la FISH:

  • Desnaturalización de la muestra de ADN.
  • Se añade sonda de hibridación marcada con un fluorócromo, que hibridará con la secuencia diana del ADN.
  • La señal emitida por la sonda se observa mediante luz ultravioleta o un microscopio de fluorescencia.

Si la FISH se realiza sobre células en metafase permite detectar microdelecciones (síndrome de Williams -pérdida de material genético en el brazo q del cromsoma 7-, del maullido, síndrome de Angelman-pequeña delección del brazo q del cromosma 15-), material genético extra o reorganizaciones del material genético (ciertos tipos de cáncer). Sobre células en interfase, la FISH permite detectar el número de uno o varios cromosomas o reorganizaciones del material genético. La prueba de aneuploidia se realiza en células procedentes de líquido amniótico con sondas específicas para los cromosomas 18, 21, X e Y (detección de trisomias).

Microarrays o Biochips

Los microarrays se definen como un gran número de moléculas (colección=array) de ADN ordenadas sobre un sustrato sólido de manera que forman una matriz bidimensional de material genético que permite la automatización simultánea de miles de ensayos con el objetivo de conocer la estructura y funcionamiento de una dotación genética. Constituyen una de las herramientas más recientes de análisis y se caracteriza por la obtención masiva de información analítica en un tiempo reducido. Los biochips son dispositivos miniaturizados capaces de incorporar grandes cantidades de material biológico (ácidos nucléicos, proteínas …) y surgen como una adaptación de los microprocesadores electrónicos en los que se sustituyen los circuitos impresos por muestras de naturaleza biológica. Su espectacular desarrollo es debido a la posibilidad de almacenar y gestionar grandes cantidades de información por el gran empuje de la investigación en bioinformática. Están constituidos por un soporte sobre el que se inmoviliza el material biológico formando una matriz ordenada de manera que se conoce en todo momento que es lo que se ha depositado en cada punto de la matriz, permitiendo su análisis, identificación y posterior interpretación. Los fragmentos de una sola hebra de material genético pueden ser: -oligonucleótidos (secuencias cortas) -polinucleótidos, -cDNA (ADN complementario sintetizado a partir de mRNA) o -productos de la PCR que se encuentran inmovilizados sobre un soporte. Los ácidos nucléicos de las muestras a analizar se marcan por diversos métodos (enzimáticos, fluorescentes…) y se incuban sobre el panel de sondas permitiendo que se produzca la hibridación de las secuencias homólogas permitiendo el análisis del ADN presente en la muestra (mutaciones, polimorfismos- el polimorfismo genético hace referencia a la existencia en una población de múltiples alelos de un gen, es decir, un polimorfismo es una variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los individuos de una población que origina cambios importantes en la estructura de la proteína que codifica o en el mecanismo de función de la expresión-…). Mediante un escáner y un software informático se analizan los datos obtenidos permitiendo la interpretación de los resultados. Su principal ventaja reside en la posibilidad de analizar simultáneamente miles de genes. Actualmente se aplica a: __análisis de expresión génica – útil en la clasificación, el diagnóstico y tratamiento de enfermedades ligadas a patrones de expresión génica específicos-, __detección de mutaciones y polimorfismos, __tratamientos personalizados en determinados grupos de pacientes, __seguimiento de terapia,__medicina preventiva,__screening y toxicología de fármacos y diagnóstico molecular.

Aplicaciones de los Biochips en el Cáncer

El cáncer ha sido considerado tradicionalmente como una enfermedad única aunque existen más de 200 tipos de cáncer diferentes que se producen con distinta frecuencia en todos los órganos y tejidos corporales. Cada uno de ellos presenta distintas variantes unas más agresivas que otras lo que lleva a que unas sean tratables y otras tengan un pronóstico peor. El diagnóstico precoz, el tratamiento y el seguimiento de la enfermedad son esenciales para la supervivencia del enfermo con cáncer. Los marcadores tumorales, utilizados en el diagnóstico y seguimiento del cáncer no presentan la anticipación necesaria y tasas de falsos resultados (positivos y negativos) demasiado altas. Los avances en biología molecular amplia las posibilidades de identificación de nuevos marcadores y su utilización clínica. Las técnicas de análisis molecular han permitido determinar el genotipo tumoral (determina las mutaciones en el ADN que causan la proliferación celular) y el perfil de expresión génica y proteica de los distintos tipos de cáncer que explica el que procesos patológicos similares presentaran una respuesta radicalmente distinta al tratamiento.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de una mínima cantidad (teóricamente es suficiente una única copia de ese fragmento original). Esta técnica nos permite detectar in vitro una secuencia de nucleótidos determinada de ADN mediante un proceso que imita la replicación del ADN in vivo pero amplificando el proceso hasta obtener más de un millón de veces la secuencia original.

Amplificación del ADN Mediante PCR

La técnica de la PCR está automatizada mediante un aparato llamado termociclador de PCR, que permite calentar y enfriar los tubos de reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reacción (ver más abajo) regulando la entrada y salida de agua a las temperaturas necesarias en las distintas etapas. Los termocicladores más modernos hacen uso del efecto Peltier para calentar y enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente el equilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobre los tubos de reacción.

Cebadores o Primers

Los cebadores, primers o iniciadores son oligonucleótidos con una secuencia de 15 a 30 nucleótidos, complementaria de las zonas terminales de la secuencia del ADN desnaturalizado que queremos amplificar. Como cada molécula de ADN está compuesta por dos cadenas, para la realización de la PCR necesitamos dos tipos de cebadores, uno para cada una de las dos cadenas. Cada cebador suele fijarse en el extremo 3´ de la cadena de ADN que le sirve de molde. Será el inicio de la síntesis de la copia que deseamos obtener que se prologará hasta que encuentre el triplete que indica fin de síntesis. Los dos cebadores delimitan un fragmento de amplificación que se denomina AMPLICÓN.

Otras características de los cebadores son:

  • Tener una distribución de bases equilibrada: porcentaje de guanina+citosina del 50%.
  • La secuencia de sus nucleótidos no debe tener gran complementariedad para evitar la formación de dímeros que conllevarían una disminución de la eficacia de la amplificación.
  • No deben tender a la formación de estructuras secundarias.
  • Se obtienen mediante sintetizadores de ADN en el laboratorio.