Técnicas de Tinción Histoquímicas

Definición: Aplicación de reacciones químicas y bioquímicas sobre tejidos histológicos con el fin de localizar y determinar ciertas sustancias.

Tinción Histoquímica para Hidratos de Carbono

PAS (Ácido Periódico de Schiff)

El material PAS positivo se ve rojo o magenta. Detecta polisacáridos simples y complejos.

Protocolo:

  • Desparafinar e hidratar.
  • Ácido peryódico 0.5%, 5 min.
  • Lavar en agua.
  • Reactivo de Schiff, 15-30 min.
  • Bisulfito sódico 3-5 min para aclarar el reactivo de Schiff.
  • Agua corriente.
  • Hematoxilina de Carazzi 3-5 min.
  • Agua.
  • Montaje.
  • Observamos núcleos azules, glucógeno morado y el material PAS positivo de color rosado.

Azul Alcián

Los mucopolisacáridos ácidos se tiñen de azul.

Procedimiento:

  • Filtrar soluciones antes de usar.
  • Desparafinar e hidratar.
  • Tratar con la solución de azul alcián 30 min.
  • Lavar con agua.
  • Contrastar si se desea con rojo nuclear.
  • Deshidratar, aclarar y montar.

Azul de Toluidina

  • Más habitual.
  • Sustancias con carácter metacromático se verán de color rojo y el resto se verá en azul.
  • La reacción metacromática presenta grandes variaciones ante pequeños cambios del medio.
  • Los baños de etanol la inhiben, por lo que deben realizarse preparaciones testigo.

Protocolo:

  • Desparafinar e hidratar.
  • Teñir con azul de toluidina, 2-5 min.
  • Lavar en solución tamponada.
  • Tratar los cortes en solución de molibdato 10 min.
  • Lavar con agua.
  • Deshidratar, aclarar y montar.

Histoquímica de Grasa, Proteína y Ácido Nucleico

  • Rojo Congo: Detección de proteína amiloide.
  • Fontana-Masson: Detección de melanina, gránulos argentafines y cromafines o pigmentos como la lipofucsina.
  • Grimelius: Detección de proteína en los gránulos argentafines y argirófilos.
  • Reticulina: Diferenciar tipos de colágeno, tipo I (marrón), tipos III y IV (negro) y para diferenciar las membranas basales que tienen colágeno tipo IV.
  • Tricrómico de Masson: Combina distintos colorantes: colágeno tipo I azul oscuro, tipos III y IV azul claro; mucina de verde o azul; núcleo negro; queratina y músculo liso de rojo.

Técnicas para Microorganismos

  • Giemsa: Tinción rutinaria, formada por azul de metileno como colorante básico y eosina como tinte ácido.
    • pH entre 6,4 y 6,9 de forma crítica.
    • Permite ver en detalle los núcleos.
    • Citoplasma rosa, núcleos azules, los glóbulos rojos naranja, gránulos de los mastocitos de color púrpura, las bacterias y los parásitos azules.
  • Ziehl-Neelsen: Se emplean en la detección de micobacterias.
    • Son bacilos ácido-alcohol resistentes. Se verán de color rojizo.
  • Gram: Diferenciación entre bacterias G+ (azul) y – (rojo).
  • Plata metenamina y otras: Para detección de hongos y Pneumocystis, que se ven de color negro.
  • PAS: Hongos.

Lecitinas

Proteínas unidas a oligosacáridos o carbohidratos de manera específica, pueden usarse como los anticuerpos en inmunohistoquímica para obtener una reacción colorimétrica.

Equipamiento y Procesos en Histotecnología

Equipos para Histotecnología en un Laboratorio de AP

  1. Estación de tallado
  2. Procesador tisular
  3. Parafinero
  4. Microtomo
  5. Baño de flotación
  6. Estufa
  7. Centrífugas
  8. Citocentrífugas
  9. Moldes para citocentrífugas
  10. Campana extractora de seguridad
  11. Teñidores

Datos Necesarios en un Volante de Muestra

  1. Datos del paciente
  2. Datos del servicio y del médico que ha obtenido la muestra
  3. Origen anatómico de la biopsia
  4. Resumen de la historia clínica que ayude al diagnóstico
  5. Posible diagnóstico por el que se remite para ser estudiado

Aspectos en la Descripción Macroscópica de una Pieza Quirúrgica Grande

  1. Tamaño
  2. Color
  3. Forma
  4. Peso
  5. Superficie externa
  6. Consistencia
  7. Tacto

Esquema del Proceso desde la Recepción de la Muestra hasta el Informe Diagnóstico

Recepción de muestra > Registro > Tallado o muestreo > Inclusión en parafina > Cortes > Tinción > Emisión de informe > Archivo.

Ventajas y Desventajas del Uso del Procesador Tisular

Ventajas:

  • Eficiencia y automatización
  • Uniformidad en el procesamiento
  • Reducción de errores
  • Mejora en la calidad del tejido
  • Seguridad
  • Flexibilidad en el tiempo de procesamiento

Desventajas:

  • Coste del equipo
  • Dependencia de la automatización
  • Riesgo de daño en los tejidos derivados
  • Tiempo fijo de procesamiento
  • Requiere mantenimiento especializado
  • Espacio físico

Artefactos Causados por un Mal Procesamiento de la Muestra

  • Fijación: Mala fijación puede distorsionar la forma, el color o el aspecto de la muestra.
  • Tallado: No hay que dejar secar demasiado las muestras para evitar el deterioro de la estructura tisular y dañar las células.
  • Procesado: Mala deshidratación no dejará penetrar la parafina, dificultando el corte y el diagnóstico.
  • Coloración: Exceso o defecto de tinción no permitirá ver correctamente las estructuras tisulares y dificultará el diagnóstico.
  • Reactivos de tinción mal elaborados, conservados, utilizados o caducados: Pueden provocar precipitados y depósitos de productos sobre los tejidos.
  • Montaje: Pueden ocasionar cortes y arañazos en los cortes, perdiendo parte de la muestra.

Decalcificadores: Características y Normas de Utilización

Características:

  • Se realiza de forma rutinaria en tejidos mineralizados.
  • El decalcificante ideal debe producir la eliminación completa de los depósitos cálcicos.
  • Se emplean ácidos fuertes o débiles.
  • Ácido nítrico: el más rápido y eficaz.
  • HCl: no es tan rápido como el anterior.
  • Ácidos orgánicos: producen escasos artefactos y apenas interfieren en la tinción.

Normas de Utilización:

  • Fijación completa para disminuir en lo posible los efectos alterativos del decalcificador.
  • La concentración del agente decalcificador debe ser óptima.
  • El decalcificador debe encontrarse en un volumen muy elevado y debe ser renovado frecuentemente.
  • No deben dejarse los bloques suspendidos en el fondo del envase, ya que en él se acumulan las sales cálcicas solubles.
  • Temperatura ideal: 25°C.
  • Después de la decalcificación hay que lavar las piezas con líquidos neutralizantes.

Acelerar el Proceso:

  • Aumentar la temperatura por encima de los 25°C pero sin llegar a 60°C.
  • Aplicando agitación manual o mecánica.
  • Añadiendo alguna resina de intercambio iónico.
  • Mediante ultrasonidos.

Microtomía y Técnicas de Corte

Precauciones al Cortar un Bloque en el Micrótomo

Preparación adecuada del bloque, control de temperatura, ajuste de cuchillas, grosor del corte, uso del microtomo, manejo de los cortes, seguridad personal.

Orientación del Portabloques

Nos ayudaremos de un bloque de parafina.

Micrótomo de Uso Rutinario en un Laboratorio de Anatomía

Ultramicrotomo

Grosor Correcto de los Cortes de Rutina

De 1 a 10 µm.

Temperatura Idónea del Baño de Flotación

40-50°C.

Tipo de Cuchilla No Utilizada para Micrótomo

Biconvexa.

Sustancia para Aumentar la Adherencia al Portaobjetos

Polilisina.

Causa Probable de Cortes Arrugados

El bloque no está suficientemente frío.

Secado del Portaobjetos

60°C durante 30 minutos.

Función del OCT

Es un medio sintético para mejorar la congelación.

Grado de Inclinación de la Cuchilla del Micrótomo Más Habitual

10-15°.

Utilización del Criostato

Para cortar biopsias intraoperatorias.

Utilización del Ultramicrotomo

Para microscopía electrónica.

Medidas para Evitar el Desprendimiento de Cortes

A y b son correctas (No se especifican en el texto original).

Función de la Lámina de Plástico o Cristal en Criostatos

Evitar que el corte se enrolle (sistema antirrol).

Afirmación Correcta Sobre el Portacuchillas del Micrótomo

Todas las anteriores son correctas (No se especifican en el texto original).

Inmunohistoquímica

Opción Falsa

Todas las respuestas anteriores son falsas (No se especifican en el texto original).

Ventaja del Método de Marcaje de Anticuerpos Directo

Es una técnica rápida.

Principal Limitación de la Inmunofluorescencia

Fotobleaching.

Enzima Utilizada con Mayor Frecuencia en el Marcaje de Anticuerpos

Peroxidasa.

Principales Técnicas de Recuperación Antigénica

Inducción por calor y digestión enzimática.

Sustancia para Bloquear la Actividad Endógena de la Peroxidasa

Metanol con peróxido de hidrógeno.

Respuesta Correcta Sobre los Controles en Inmunohistoquímica

Para el control negativo se emplean tejidos de los que se sabe que no disponen del antígeno problema.

Principal Inconveniente de las Técnicas Basadas en la Peroxidasa

Demasiado específicas.

Paneles Inmunohistoquímicos para Sospecha de Adenocarcinoma de Pulmón

CK7, TTF1, BerEP4.

Afirmación Correcta

Todas son correctas (No se especifican en el texto original).