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Operón y Regulación de la Expresión Génica
Operón
El operón es la unidad génica funcional policistrónica bacteriana. Incluye genes estructurales, una región promotora, una región operadora y un gen regulador.
Promotor
Secuencia en el DNA a la cual se une la enzima RNA polimerasa antes de iniciar la transcripción.
Operador
Secuencia en el DNA donde se unen los represores.
Represor
Proteína reguladora de expresión génica que al unirse al DNA inhibe la transcripción. Ejerce un control negativo.
Activador transcripcional
Proteína reguladora de expresión génica que se une al DNA y promueve la transcripción. Ejerce un control positivo.
Inductor
Molécula que modifica al represor y así facilita la transcripción.
Correpresor
Es una proteína que reduce la expresión génica mediante su unión a un activador o un factor de transcripción que contiene un dominio de unión a DNA.
Aporrepresor
Proteína que interacciona con un represor y permite que este se una al operador y regule la expresión de un gen.
Expresión constitutiva
Es decir, aquellos que se transcriben permanentemente independiente de las condiciones ambientales.
Expresión regulada
En función de las condiciones ambientales. Dentro de esta categoría, se distinguen a su vez: operones de expresión inducible y operones de expresión reprimible.
Gen estructural
Gen que codifica para enzima de una vía metabólica
**PLASMIDIAL.-
1. Crecer el cultivo de E. coli toda la noche en caldo terrific.
2. Centrifugar las células por 1 minuto (2 ml de cultivo).
3. Desechar el sobrenadante.
4. Centrifugar 5 segundos.
5. Quitar cualquier líquido restante del tubo con una pipeta. (Este paso es crítico)
6. Suspender las células en 50 ul de la solución de suspensión celular: Tris, EDTA, RNase A
7. Agregar 100 ul de solución del lisis celular: SDS/NaOH.
8. Invertir 4 veces suavemente.
9. Agregar 325 ul de la solución de neutralización: acetato de potasio
10. Invertir 4 veces.
11. Centrifugar 1 minuto.
12. Transferir el sobrenadante a la columna de filtración.
13. Centrifugar la columna por 30 segundos.
14. Desechar el líquido pasado en el tubo de colección.
15. Lavar con 700 ul de solución de lavado: EtOH, Tris, NaCl.
16. Centrifugar 30 segundos. Eliminar el pasado.
17. Lavar nuevamente con 300 ul de sol. De lavado y centrifuga por 20 segundos.
18. Transferir cuidadosamente la columna a un tubo nuevo del microcentrífuga.
19. Agregar 50 ul de Tampón de elusión: Tris-HCl en el centro del filtro presente en la columna.
20. Centrifugar 30 segundos.
21. Retirar la columna y conservar el ADN plasmidial a -20°C
SOL DE RESUSPENSIÓN:
Resuspensión (P1), que contiene RNAasa A (100ug/mL), un buffer que optimiza su actividad enzimática y EDTA, que es necesario para quelar los metales cofactores de las DNAasas. La RNAasa cataliza la hidrólisis del RNA con el fin de evitar una eventual contaminación, pues como se mencionó anteriormente el DNA plasmídico queda en solución junto con todos los RNA.
SOL DE LISIS:
Buffer de lisis (P2), el cual incuye SDS y NaOH. El SDS es un detergente iónico que rompe las membranas de las células y desestabiliza todas las interacciones hidrofóbicas que poseen varias macromoléculas en su conformación nativa. El pH alto que origina el NaOH también desnaturaliza las macromoléculas cambiando la condición de grupos ionizables. Estos dos componentes del buffer, provocan la ruptura de las paredes celulares y desnaturalización de proteínas.
SOL DE NEUTRALIZACIÓN:
Neutralización (P3) frío que contiene acetato de potasio (AcOK). El pH bajo de la solución del acetato del potasio neutraliza el NaOH. Cuando el pH se aproxima a la neutralidad comienzan a renaturalizarse las macromoléculas. Sin embargo, el DNA genómico no renaturalizan correctamente. El DNA genómico forma enlaces hidrofóbicos, iónicos y puentes hidrógeno no específicos debido a que la conformación correcta de la molécula no fue mantenida durante la desnaturalización