Sistemas de Expresión de Saccharomyces cerevisiae

Ventajas:

  • Células eucariotas similares a las de mamíferos.
  • Genética y fisiología bien conocidas.
  • Cultivo a gran escala posible.
  • Disponibilidad de numerosos promotores.
  • Capacidad de realizar modificaciones postraduccionales.
  • Liberación extracelular de proteínas heterólogas.
  • Organismo seguro (GRAS) de uso industrial.

Desventajas:

  • La presencia de proteasas activas puede reducir el rendimiento del producto. Se dispone de huéspedes modificados deficientes en algunas proteasas.

Técnicas para Transformar Levaduras

  • Generación de protoplastos: eliminación química o enzimática de las paredes celulares.
  • Tratamiento con acetato de litio.
  • Electroporación.

Productos Recombinantes Producidos por Levaduras

Vacunas:

  • Hepatitis A y B.
  • Malaria (proteína del esporozoíto).

Antígenos para Diagnóstico:

  • Hepatitis C (proteína viral).
  • Antígenos del VIH-1.

Agentes Terapéuticos:

  • Insulina.
  • Factores de crecimiento de fibroblastos.
  • Alfa-1 antitripsina.
  • Factor de coagulación sanguínea XXIa.

Sistemas de Expresión en Células de Insectos

Uso de Baculovirus

  • Infecta a 30 especies de insectos.
  • Utilizado como vector de expresión.
  • Baculovirus recombinante AcMNPV (Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus).
  • Larvas de Trichoplusia ni infectadas con AcMNPV portador de ADNc de adenosina deaminasa humana (9 mg/l de producto purificado. Rendimiento del 2 al 5%).

Ventajas:

  • Sobreexpresión del producto.
  • Correcto plegamiento de las proteínas.
  • Modificaciones postraduccionales similares a las de las células humanas.

Problemas:

  • Limitaciones para la producción a gran escala.
  • Equipamiento especializado.

Sistemas de Expresión en Células de Mamíferos

  • Líneas celulares (HELA) utilizadas cuando la producción en otros sistemas no es viable.

Medios de Transfección de Células Animales

  • Incubación del ADN con células coprecipitadas con fosfato de calcio o DEAE-dextrano.
  • Electroporación.

Razones de Uso:

  • Mantenimiento de virus durante múltiples generaciones.
  • Uso de virus como vectores de expresión: BKV, SV40, poliomavirus.
  • Vectores lanzadera: sistemas de expresión que utilizan genes virales y plásmidos de E. coli. Sistema DHFR-MTX.

Ventajas:

  • Obtención de proteínas recombinantes funcionales.

Desventajas:

  • Se requiere equipamiento sofisticado.
  • Personal altamente cualificado.
  • Costos de producción elevados.

Desventajas de las Vacunas Tradicionales

  • No todos los organismos pueden cultivarse a gran escala.
  • Consideradas menos seguras.
  • Las cepas atenuadas pueden revertir a su estado infeccioso.
  • Inactivación incompleta.
  • Caducidad limitada.

Ventajas de la Tecnología del ADN Recombinante

  • Inmunidad activa.
  • Vacunas producidas a partir de genes de virulencia.
  • Sin riesgo de reversión a formas infecciosas.

Características:

  • El antígeno se genera a partir de un gen específico.
  • Se clonan en vectores de expresión.
  • Se producen en huéspedes de expresión.
  • Se pueden producir subunidades proteicas o péptidos (dominios).

Diagnóstico de Enfermedades Genéticas

Detección del gen responsable:

  • Ausencia del gen.
  • Defecto causado por deleción.
  • Defecto causado por una mutación puntual.
  • Defecto causado por translocación.
  • Defecto causado por un aumento de trinucleótidos repetitivos.

Diagnóstico de Enfermedades Infecciosas

  • Detección directa del agente etiológico.
  • Detección visual por microscopía.
  • Cultivo del agente patógeno.

Desventajas:

  • Algunos parásitos son morfológicamente indistinguibles.
  • Dificultad para detectar patógenos ocultos en los tejidos.
  • Baja sensibilidad.
  • Patógenos difíciles de cultivar.
  • Contaminación de los cultivos con hongos.
  • Mayor tiempo de crecimiento de los patógenos en cultivo.

Detección Indirecta por Presencia de Anticuerpos

Desventajas:

  • No discrimina entre infección presente o pasada.
  • Reacciones cruzadas (debido a determinantes antigénicos compartidos por diferentes microorganismos).

Diagnóstico Molecular

Razones de Uso:

  • Especificidad para moléculas diana.
  • Sensibilidad a bajos niveles del objetivo.
  • Simplicidad y rapidez.
  • Resultados inequívocos.

Tipos de Diagnóstico Molecular

  1. Prenatal:
    • Enfermedades hereditarias.
    • Predisposición genética – sospecha clínica.
  2. Presintomático (Diagnóstico Temprano):
    • Enfermedad infecciosa (fase temprana).
    • Predisposición a enfermedades como el cáncer, autoinmunes, degenerativas, trastornos afectivos (historial clínico familiar).
  3. En Tiempo Real (Monitoreo):
    • Características del patógeno (identificación, virulencia, resistencia a fármacos).
    • Estado inmunológico (carga antigénica o cantidad de anticuerpos).
    • Estado de la enfermedad (detección de marcadores).
    • Monitoreo del tratamiento: marcadores, respuesta al tratamiento, resistencia, etc.

Protocolo de Cultivo de Saccharomyces sp.

  1. Reactivación del Cultivo: Sembrar por estría en tubos de agar PDA + cloranfenicol la cepa de levadura. Incubar a temperatura ambiente durante 48-72 horas.
  2. Proliferación Celular: A partir de la cepa reactivada, sembrar por superficie en una placa de agar PDA + cloranfenicol con la ayuda de un asa estéril. Incubar a temperatura ambiente durante 48-72 horas.
  3. Cosecha de Células y Obtención del Inóculo:
    • Colocar 3 ml de caldo glucosado o caldo Sabouraud en la placa sembrada y 5 perlas de vidrio estériles, agitar suavemente la placa hasta obtener la suspensión celular, transferir la suspensión a un matraz estéril de 100 ml y enrasar a 50 ml con caldo Sabouraud.
    • Incubar en agitación a 180 rpm durante 18 horas a temperatura ambiente.
    • Realizar el recuento celular utilizando la cámara de Neubauer (107-108 células/ml).
  4. Inmovilización de Células:
    • Mezclar la suspensión celular con 100 ml de agar-agar al 3% fundido a 42 °C (concentración celular final 107 células/ml).
    • Con la ayuda de pipetas estériles con puntas rotas, tomar agar-agar con levaduras (mantenido en baño maría a 42 °C) y dejar caer gota a gota rápidamente en aceite vegetal contenido en un frasco de vidrio sumergido en un recipiente con hielo en forma permanente.
    • Lavar las perlas con agua corriente estéril y agua destilada estéril sucesivamente para eliminar el aceite de su superficie.
  5. Producción de Alcohol Utilizando las Células Inmovilizadas:
    • Preparar un mosto de fruta de 1200-1500 ml con una concentración de azúcares reductores que oscile entre 20 y 25 °Brix.
    • Añadir las células de levadura inmovilizadas en agar-agar y dejar fermentar durante 10 días.
    • Realizar evaluaciones diarias determinando el consumo de sustrato (azúcares reductores) utilizando un refractómetro (realizar la curva de consumo de sustrato/tiempo).
    • Para la determinación del alcohol, se puede utilizar la tabla de conversión de Gravedad Específica °Brix, °Alcohol o el vinómetro.

Protocolo de Producción de Bioinsecticida

  1. Reactivación: Repicar por estría una cepa nativa de Bacillus thuringiensis en tubos con agar nutritivo. Incubar a 37 °C durante 18-24 horas.
  2. Preparación del Inóculo:
    • Proliferación celular: sembrar en toda la superficie de una placa con agar nutritivo e incubar a 37 °C durante 18-24 horas.
    • Cosecha celular:
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      • Añadir 3 ml de caldo nutritivo en la placa con el cultivo y 5 perlas de vidrio estériles. Agitar las placas suavemente hasta obtener una suspensión celular.
      • Transferir la suspensión celular a un matraz Erlenmeyer de 150 ml estéril y enrasar a 50 ml con caldo nutritivo.
    • Obtención del inóculo:
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      • Incubar el matraz Erlenmeyer con la suspensión celular en agitación a 150 rpm a temperatura ambiente durante 18-24 horas (alternativamente, en incubadora a 37 °C).
      • Realizar el recuento celular mediante siembras por incorporación en agar nutritivo de diluciones seriadas del cultivo hasta 10-5 (o mediante recuento directo con cámara de Petroff-Hausser).
  3. Preparación del Biorreactor: Utilizar un biorreactor de tipo “air lift”.
  4. Producción del Bioinsecticida:
    • Colocar el inóculo y el medio de fermentación hasta un volumen de trabajo de 2800 ml en el biorreactor (concentración inicial de 104 células/ml).
    • Insuflar aire estéril a 1.5 VVM.
    • Poner en funcionamiento durante 48-72 horas a temperatura ambiente.
    • Dejar en reposo durante 48 horas para que las células esporulen y formen los cristales proteicos.