Técnicas de Inmunología y Separación Celular

Quimioluminiscencia

• La intensidad de la coloración o de la inmunofluorescencia es proporcional a la cantidad de elemento analizado presente en la muestra.

Prueba inmunosorbente ligada a enzimas

• Prueba de unión primaria
• Se puede utilizar para detectar y cuantificar los inmunocomplejos mediante un marcador enzimático que actúa con un sustrato cromogénico adecuado.
• Se puede detectar Ag.
• El grado de transformación del sustrato incoloro a un producto coloreado se cuantifica objetivamente por espectrofotometría y es proporcional a la cantidad de inmunocomplejos formados.

Ventajas

• Método sensible
• Bajo costo
• Fácil manejo
• Permite desarrollar un gran número de muestras en un corto periodo de tiempo
• Buen equilibrio entre sensibilidad y especificidad.

Recomendaciones

• Trabajar en áreas entre 20 a 25º C.
• Alejadas de corrientes de aire y aire acondicionado.
• Tener el inserto de la prueba a mano.
• Los componentes del kit deben alcanzar una temperatura ambiente.
• Homogeneizar antes de utilizar.
• Tener en cuenta el número total de muestras a analizar.
• Llenar una hoja de resultados y control con posición de las muestras en la placa de poliestireno.
• Realizar los cálculos previos de solución de lavado a preparar.
• Tener el equipo necesario listo y en buen estado.
• El agua para reconstituir la solución de lavado debe ser destilada y estéril.
• Que la solución de lavado no presente cristales de precipitación.
• Mantener un control estricto del tiempo en cada incubación y respetarlo.
• Colocar la cantidad exacta del reactivo y muestra a analizar.
• No deben haber burbujas de aire en las puntas ni en los pocillos de la placa.

Muestras

• No utilizar muestras de sangre que estén hemolizadas o lipémicas.
• Se deben mantener de 4 a 4º C no más de 3 a 5 días.
• Se pueden mantener durante periodos prolongados si se trasvasa el suero y se almacena a temperatura de congelación de -20ºC.
• Se deben utilizar a temperatura ambiente.
• Se deben homogeneizar utilizando el vortex o manualmente por lo menos 5 veces.

Directo: ELISA tipo sandwich o de captura de antígeno, dot ELISA

Indirecto: Detección de anticuerpos, competitivo.

Detección de anticuerpo

• La reacción se lleva a cabo en los pocillos de la placa, donde se absorbe el antígeno conocido, con el suero problema.
• La actividad enzimática sobre el sustrato apropiado, añadido al final de la reacción, se revela por cambio de color cuantificable por espectrofotometría, la intensidad es proporcional a la cantidad de anti-Ig marcada captada, que a su vez es proporcional a la cantidad de Ac presentes en el suero problema.

Elisa competitivo

• Puede utilizarse para la determinación de Ac o de Ag.
• Ac. se establece como una competencia entre los Ac del suero problema y un Ac secundario (conjugado)
• La muestra se incuba con el Ag conocido para la formación de los inmunocomplejos.
• Luego se agrega el conjugado que contiene un Ac específico secundario marcado enzimáticamente.
• Este Ac se unirá al Ag libre del pocillo
• Esta reacción es la que se colorea.
• Es inversamente proporcional a la cantidad de Ac presentes en la muestra.

Enzimoinmunoenzayo

• Es aplicada a la revelación y cuantificación de los más diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos (hormonas, fármacos, Ag, Av, etc.)
• Es el primer sustituto de la técnica de radioinmunoensayo en la medición de hormonas, inmunoglobulinas, Ag y Ac en infecciones bacterianas, micóticas, parasitarias y virales.

Se procede a la fijación de uno de sus componentes a una placa sólida, estos componentes pueden ser Ag o Ac, después se pone en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario. El complejo inmunológico formado es enfrentado luego a las moléculas capaces de reconocer a su componente más superficial, marcada con una enzima (peroxidasa de rábano picante); agregando posteriormente el sustrato cromogénico de la enzima marcadora. La existencia de una reacción inmunológica se demuestra y se cuantifica midiendo espectrofotométricamente la cantidad de producto enzimático resultante.

• Técnica cualitativa: Nos indica la ausencia o presencia de Ag o Ac determinado. Los kits incluyen controles positivos y negativos para poder determinar la presencia o ausencia de Ag. (Ej: hepatitis, HIV)
• Técnica cuantitativa: Nos indica la cantidad de Ag o Ac presente en la muestra. Los ckits incluyen +/- 6 estándares con los cuales se realiza una curva para poder determinar la concentración de la muestra. (Ej. marcadores tumorales, hormonas)
• Técnica semi-cuantitativa: Nos da un indicio de la cantidad de Ag o Ac presente en la muestra con la utilización de un estándar o calibrador. (Ej: ANA, nDNA)

La técnica de ELISA se basa en la detección de un Ag inmovilizado sobre una fase sólida mediante Ac que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, puede ser medido espectrofotométricamente.

Propiedades de la técnica de ELISA: es versátil, segura, de fácil realización, emplea reactivos económicos y consigue mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre.

El método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se necesitaba la cuantificación de productos mediante Ac: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de Ac en isotipos, búsqueda de Ac monoclonales, etc.

Lectores de ELISA

Son espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa. A diferencia de un espectrofotómetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son las que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de los cromógenos más comúnmente utilizados.

Fases de ensayo de ELISA

1.- Conjugación de Ac o Ag con una enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina). El Ac conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich. El Ag se emplea en ensayos de competición de Ag.

2.- Unión de Ag o Ac a los pocillos. Esta unión se realiza con facilidad a la superficie de los plásticos tratados que tiene gran afinidad por proteínas.

3.- Formación de uno o más capas de inmunocomplejos. En el caso de del Ag unido a la placa se puede detectar mediante un Ac anti Ag marcado (E. directo) o empleando un Ac primario anti Ag y un secundario anti primario marcado (E. indirecto) este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más Ac secundarios a cada Ac primario. En el caso de un Ac unido a la placa se incuba con una mezcla de Ag y Ag marcado. Se ensayan diferentes relaciones de Ag frío frente a una cantidad fija de Ag marcado. Es el ensayo de competición de Ag.

4.- Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica mediante espectrofotometría.

TIPOS DE ENSAYO DE ELISA: permiten desde la cuantificación de un Ag, la detección de un Ac en solución o la determinación de las subclases (idiotipos) de un Ac.

ELISA DIRECTO (simple de dos capas): se prepara recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el Ag. Se incuban con Ac marcados. Indican la presencia de Ag en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina) pero en la que se tenga certeza la ausencia del Ag buscado. Así mismo se incluyen controles positivos.

ELISA INDIRECTO: las placas se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles negativos y positivos son los mismos. El sistema de detección emplea dos Ac.: uno primario contra el Ag y uno secundario marcado contra el primero. La detección tiene una mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debido a la unión de dos o más Ac secundarios por cada primario.

ELISA SANDWICH: se recubre el pocillo con un primer Ac anti Ag. Después de lavar el exceso de Ac se aplica la muestra problema en la que se encuentra el Ag, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer Ac. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo Ac anti-Ag marcado. Así pues cada molécula de Ag estará unido a un Ac en la base que lo retiene y un segundo Ac, al menos que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a su amplificación de señal que le permite el segundo Ac.

T4 (prueba ELISA para la determinación cuantitativa de Tiroxina Total (T4) en suero o plasma)

USO PREVISTO: La L-tiroxina es una hormona sintetizada y almacenada en la tiroides. Más del 99% de T4 en la sangre está unida reversiblemente a las proteínas plasmáticas (principalmente unida a tiroxina, TBG). La medición de T4 total por prueba de inmunoensayo es una de las más confiables y convenientes pruebas disponibles para determinar la presencia de problemas tiroideos. Niveles elevados de T4 han sido encontrados en hipertiroidismo debido a enfermedad de Grave y de Plummer así como en tiroiditis aguda y subaguda. Bajos niveles de T4 han sido asociados con cretinismo, mixedema, enfermedad de Hashimoto y algunas anormalidades genéticas.

PRINCIPIO EIA COMPETITIVO: La prueba de T4 Elisa está basada en el principio de competitiva entre el T4 de la muestra y el conjugado de T4-peroxidasa por un número limitado de uniones en el pocillo con anti-T4 (oveja). Así la cantidad de conjugado T4-peroxidasa que se une al pocillo es inversamente proporcional a la concentración de T4 en la muestra. Después de la incubación con la muestra el conjugado de T4-peroxidasa sin unir y en estado de equilibrio es removido por lavado. La solución se sustrato se agrega y se desarrolla un color azul. La intensidad de este color, el cual cambia a amarillo al agregarle la solución de parada, es inversamente proporcional a la cantidad de T4 en la muestra. Se lee a 450nm

REACTIVOS:

CON: Enzima conjugado-antigénico (conjugado T4-HRP, en una matriz proteica estabilizada)

C-DIL: Buffer para el conjugado (buffer de fosfato)

WS: Solución de lavado, concentrado para 1000 ml. Buffer MOPS salino.

SA: Reactivo sustrato A. 3, 3′,5,5′- tetrametilbenzidina (TMB) buffer acetato de sodio.

SB: Peroxido de urea hidrogeno, buffer de acetato de sodio.

STOP: Solución de parada, ácido sulfúrico.

Notas de seguridad:

No ingerir los reactivos. Evitar el contacto con los ojos, piel y membranas mucosas. Todas las muestras de pacientes CAL deberían ser manipuladas como posibles agentes infecciosos. CAL han sido encontrados para HBsAg y Ac contra VHC y VIH 1+2 en los donantes. Usar ropa protectora y guantes desechables según las buenas prácticas de laboratorio. Todos los materiales contaminados con muestras CAL deben inactivarse por métodos aprobados (autoclavado o tratamiento químico) según las regulaciones aplicables.

ESTABILIDAD: Los reactivos son estables hasta las fechas de expiración señaladas en las etiquetas individuales cuando se almacenan a 2…8ºC. Después de abiertos, los reactivos deben almacenarse a 2..8ºC y utilizarse dentro de 60 días.

Solución de Lavado: Solución que contiene NaCl- buffer TRIS, para preparar en 1000 ml de agua desionizada.

Substrato: Solución que debe ser preparada en la cantidad necesaria mezclando en iguales proporciones SA y SB. Usar un envase plástico limpio previamente enjuagado con agua desionizada. Verter el contenido de un frasco de SA en un frasco de SB y mezclar. Almacenar de 2° a 8°C. Almacenar protegida de la luz intensa.

Utilizar dentro de 30 días. 2…8ºC

MUESTRA: Suero o plasma (EDTA, Heparina), no usar muestras hiperlipémicas o hemolizadas. Las muestras pueden almacenarse por 48 horas a 2…8ºC o por hasta 30 días a -20ºC. Congelar y descongelar solamente una vez. Al descongelar una muestra debe ser homogeneizada. Eliminar el material particulado por centrifugación o filtración.

Procedimiento.

En este caso se determinaron 2 muestras problemas y la técnica se realizará por duplicado

Seguir el procedimiento exactamente como se describe.

Notas de uso

U1: No usar o mezclar de diferentes números de lote. No mezclar tapas de envases (riesgo de contaminación). No usar reactivos después de sus fechas de expiración.

U2: No usar reactivos que pueden ser contaminados o que tienen aspecto diferente u olen diferentemente que normal.

U3: Notar el reparto (CAL), las muestras y los controles cuidadosamente en la hoja provista en el estuche.

U4: MIC- sacar el número requerido y colocarlos firmemente en el portatiras.

U5: Analizar cada CAL, control o muestra por duplicado. Pipetearlos en el fondo de los microposillos.

U6: siempre deben agregarse los reactivos en el mismo orden y tiempo para minimizar diferencias en los tiempos de reacción entre los microposillos. Es importante para obtener resultados reproducibles. El pipeteo de las muestras no debería exceder de los 10 minutos. De lo contrario pipetear la curva CAL en las posiciones indicadas en la mitad del intervalo de la serie . si se emplea más de una placa, repetir la curva de calibración para cada placa.

U7: Evitar/remover de aire antes de las incubaciones y lecturas de absorbancia.

U8: SUB inicia y STOP termina una reacción cinética. Evitar la luz intensa durante el desarrollo del color.

U9: después de cada pipeteo agitar suavemente durante 20-30 sec. Sin verter las soluciones para asegurar una buena mezcla. Si está disponible, mezclar en un mezclador de pocillos (p.ej. HUMAREADER)

Procedimiento de lavado

El procedimiento de lavado es crítico. Un lavado insuficiente producirá una mala precisión o absorbancias falsamente elevadas.

L1: remover las tiras adhesivas, aspirar el contenido o dejar caer en la zona de lavado o eliminación de reactivos, agregar WASH, aspirar después de aprox. 30sec. De enjuague y repetir el lavado.

L2: en el caso de lavadores automáticos, se deben cebar con WASH y lavar los pocillos 3 veces. Asegurarse que el lavador llene los pocillos completamente y aspire eficientemente después de 30 sec. (Liquido remanente 15>

L3: después del lavado, remover el líquido remanente invirtiendo los micropocillos sobre papel absorbente.

Datos de rendimiento: la prueba de T4 elisa tiene una sensibilidad analitica de aprox. 0.4 ug/dl T4, las muestras con T4-concentraciones sobre 25 ug/dl pueden diluirse con CAL A y ser reanalizados.

T3

prueba de ELISA para la deterinacion cuantitativa de triyodotironina total en suero o plasma humano.

 la concentracion de T3 es mucho menor que la de T4, pero su potencia metabolica es mucho mayor.la determinacion de T3 es una de las herramientas mas importantes en el diagnostico de la enfermedad tiroidea. su determinacion ha descubierto una variedad de hipertiroidismodonde los pacientes tirotoxicos presentas valores elevados de T3 con valores normales de T4. un aumento de de t3 sin elevacion de T4 es frecuentemente indicativo de tirotoxicosis recurrentes en paciente spreviamente tratados. el significado clinico de T3 es evidente en pacientes donde el eutirodismo es atribuido a T3 normal con valores subnormales de T4. la determinacion de T3 es util en el monitoreo de pacientes bajo tratamientos para hipertiroidismo y pacientes que han descontinuado la terapia antitiroidea. es especialmente util para diferenciar sujetos eutiroideos de sujetos hipertiroideos. los niveles de T3 se elevan en el embarazo, ingesta de anticonceptivos orales o tratamientos estrogenos, paralelamente la TBG, se incrementa de manera analoga a la T4. de la misma manera una disminucion de TBG disminuye la concentracion de T3. sin embargo estos cambios del nivel de T3. la mejor informacion diagnostica acerca de la tirostasis en estas situaciones se puede obtener con la prueba de TRH.

datos de rendimiento: la prueba de T3 ELISA tiene una sensibilidad analitica de aprox. 4pg/ml T3.  las muestras con T3 concentrados sobre 7.5ng/ml pueden diluirse con CAL A y ser reanalizados

TSH

Prueba ELISA para la determinacion cuantitativa de tirotropina en suero humano.

la tirotropina es una hormona glicoproteinica de aprox de 28kd, secretada por la glandula pituitaria anterior. es considerada el indicador disponible mas sensible para el diagnostico del hipotiroidismo primario y secundario. aumento de TSH en suero es indicador  es indicador sensible y tempranode disminucion en la reserva tiroidea y en conjunto con la disminucion de T4 se diagnostica hipotiroidismo primario. el incremento inesperado de TSH demuestra la clasica retroalimentacion negativa del sistema entre las glandulas tiroidea y pituitaria.  ademas la determinacion de TSH es util en la diferenciacion del hipotiroidismo secundario y terciario de la enfermedad tiroidea primaria. en el hipotiroidismo secundario y terciario, las concentraciones de T4 son usualmente bajas y los niveles de TSH son generalmente bajos o normales.

Principio sandwich EIA: usa un Ac monoclonal anti-TSH alatamente especificoque esta fijado en la superficie de los micropocillos, en el primer paso de incubacion, las muestras, los calibradores o controles y el conjugado enzimatico ( anti-TSH marcada con peroxidasa) se forma el complejo tipo sandwich el cual se une a la superficie de los micropocillos poe ser fijado al Ac inmovilizado. al final de la incubacion el exceso de conjugado enzimatico y Ac monoclonales son eliminados por el lavado. se agrega el reactvo sustrato  (etapa 2) y el color resultante. el cual cambi a amarillo luego de agregar la solucion de parada, es medido fotometricamente. el incremento de absorbacia es directamente proporcional a la concentracion de TSH en la muestra.

aqui s eprepara solo la solucion de lavado.

valores esperados: 0.3-6.2 mUI/l TSH

datos de rendimiento: tiene una sensibilidad analitica de 0.10>

inmunofluorecencia indirecta

se utiliza para reconocer Ag de superficie de celulas o tejidos, atraves d eun Ac especifico que e scapaz de reconocer el Ag. este primer Ac no se utiliza marcado y para poder visulaizar una reaccion Ag -Ac positiva, se utiliza un segundo Ac marcado con un fluorocromo dirigido contra la especie del primer Ac. una variante de esta tecnica es la que utiliza biotina y posteriormente se añade avidina o estreptovidina conjugada con el fluorocromo.

una d elas metodologias d ela tecnica consiste en incubar el Ag a valorar de la muestra con el primer Ac especifico que se ha fijado al cubreobjeto, luego se le añade un an-Ac marcado con fluoroforoque s eunira al complejo fijado al portaobjeto. y tras una nueva incubacion y un lavado se visualiza la positividad o no del ensayo visualizandolo en un microscopio con lampara ultravioleta ( epifluorescencia).

otra variante de IFI, consiste en fijar las celulas o tejidos a una superficie (portaobjetos con pocillos) y luego incubar la muestra con el primer Ac. luego se coloca el segundo Ac y posteriormente un conjunto con avidita-FITC(marcado con la fluorescencia).

ejemplos de IFI

a.- TRIPANOZOMA CRUZI. la deteccion de Ac contra el parasito puede ser efectuada por diferentes tecnicas ELISA; aglutinacionhemaglutinacion, Latex.

sin embargo, IFI son extremadamente sensibles y especificos para el diagnostico de enfermedad de Chagas, dan resultados positivos tanto las infecciones tempranas.

deteccion de Ac sericos anti-Tripanosoma cruzi: el suero del paciente en una dilucion adecuada, se enfrenta con las improntas que contiene el parasito. los Ac especificos, si estan presentes, se unen al sustrato Antigenico. luego de lavar para eliminar los componentes no unidos, los Ac unidos reaccionan con la anti- Ig marcada con FITC . un segundo lavado elimina los elementos no unidos. finalmente, luego de montados se observa bajo fluorescencia.

b.- Echinococcus granulosus: se ha recomendado esta tecnica sobre el sustrato de escolex del parasito por ser altamente sensible y especifica, tambien presenta notoria ventajas en cuanto a la rapidez y practicidad. se deterinan Ac sericos dirigidos contra el Echinococcus granulosus. el suero del paciente se enfrenta con las improntas que contiene cortes de escolex de E. granulosus.

los Ac especificos, si estan presentes se unen al sustrato antigenico . luego de lavar para eliminar los componentes no unidos. los Ac unidos reaccionan con la Anti Ig maracad con FITC, un segundo lavado elimina los elementos no unidos. y finalmente luegod e montados son observados bajo microscopia de fluorescencia.

AUTOINMUNIDAD: rechazo de sustancias extrañas, rechazo de los injertos. es debido a una funcion inapropiada del sistema inmunologico se puede producir una reaccion dirigida contra los propios constituyentes del organismo

AUTOANTICUERPOS: son Ac fabricados por un individuo contra estructuras de su propio organismo. estos autoanticuerpo van dirigidos contra muchos organos como por ejemplo los ANA.

AC ANTINUCLEARES: son una gran variedad de autoanticuerpos contra componentes del nucleo celular ( ej: ARN, ADN) y otras proteinas nucleicas.  ANA s eencuentra en pacientes con enfermedades del tej. conjuntivo, particularmente en LES. ANA negativo descarta LES,otras enfermedades del tej. conjuntivo como artritis reumatoide, esclerodermia y dermatomiositispresentan a menudo ANA positivo.

– el metodo de IFI es de  determinacion para el screnneng de ANA circulante. se recomienda que todas las muestras de ANA positivas sean tituladas hasta el punto final y sena investigadas a autoanticuerpos contra DNA de doble filamento (dsDNA) y Ag de nucleo extraibles (ENA).

– hoy en dia se usan las celulas HEp-2, que proviene de una linea celular derivada de un carcinoma de laringe humano. estas celulas se caracterizan comparandolas con otras lineas celulares por un nucleo extremadamente grande. con la utilizacion de celulas Hep-2 en el screnning se pueden observar tres ventajas diferenciales:

• el substrato antigenico esta estandarizado, por lo que existe una muy baja variabilidad entre lote y lote contrariamente que con el tejido de roedor.
• las cel. hep-2 son ma sgrandes que la del tejido de rata, permitiendo asi una mejor visualizacion de la morflogia de la celula y por lotanto un aumento de la sensibilidad del test.
• la mayoria de las cel. HEp-2 se dividen activamente, exponiendo asi Ag que normalmente no se manifiestan en las cel del tej d erata.

FUNDAMENTO: el test se basa en IFI. tanto la muetsras de los pacientes como los controles correspondientes se incuban con cel HEp-2 mediante lavado se eliminan los Ac que no han reaccionado y despues se aplica el conjugado de fluorescencia. el conjugado sobrante se elimina por medio del proceso de lavado. los portas son examinados bajo microscopio de fluorescencia dando las muestras positivas una fluorescencia de verde manzana en las areas de union entre la cel HEp-2 y los Ac.

negativo: si la coloracion el nucleo es igual o menor al control negativo.

positivo: la coloracion del nucleo es mayor al control positivo y se percibe claramente el patron.

• quimioluminiscencia.
• la intensidad de la coloracion o de la inmunofluorescencia es proporcional a la cantidad de elemento analizado presente en la muestra.

Prueba inmunosorbente ligada a enzimas.

• prueba de union primaria
• se puede utilizar para detectar y cuantificar los inmunocomplejos nediante un marcador enzimatico que actua con un sustrato cromogenico adecuado.
• se puede detectar Ag.
• el grado de transformacion del sustrato incoloro a un producto cooreado se cuantifica objetivamente por espectrofotometria y es proporcioanl a la cantidad de inmunocomplejos formados.

Ventajas

• metodo sensible
• bajo costo
• facil manejo
• permite desarrolllar un gran numero de muestras en un corto periodo de tiempo
• buen equilibrio entre sensibilidad y especificidad.

Recomendaciones

• trabajar en areas que estes entre 20 a 25º C.
• alejadas de corrientes de aire y aire acondicionado.
• tener el inserto de la prueba a mano.
• los componentes del kit deben alcanzar una temperatura ambiente.
• homogenizar antes de utilizar.
• tener en cuenta elnumero total de muestras a analizar.
• llenar una hoja de resultados y control con posicion de las muestras en la placa de poliestrireno.
• realizar los calculor previos de solucion de lavado a prepara.
• tener el equipo necesario listo y en buen estado.
• el agua para reconstituir la solucion de lavado debe ser destilada y esteril.
• que la solucion de lavado no presente cristales de precipitacion.
• mantener un control estricto del tiempo en cada incubacion y respetarlo.
• colocar la cantidad exacta del reactivo y muestra a analizar.
• de deben haber burbujas de aire en las puntas ni en los fositos de la placa.

MUESTRAS

• no utilizar muetsras de sangre que esten hemolizadas o lipemicas.
• se deben mantener de 4 a 4º c no mas de 3 a 5 dias.
• se puede mantener durante periodos prolongados si se trasvasa el suero y se almacena a temperatura de congelacion de -20ºc.
• se deben utilizar a temperatura ambiente.
• se deben homogenizar utilizando el vortex o manualmente por lo menos 5 veces.

DIRECTO: elisa tipo sandwich o de captura de antigeno, dot elisa.

INDIRECTO: deteccion de anticuerpos, competitivo.

deteccionde anticuerpo

• la reaccion se lleva a cabo en los fositos de la placa, donde se absorbe el antigeno conocido, con el suero problema.
• la actividad enzimatica sobre el sustrato apropiado, añadido al final de la reaccion, se revela por cambio de color cuantificable por espectrofotometria, la intensidad es proporcional a la cantidad de anti-ig marcada captada, que a su vez es proporcional a la cantidad de Ac presentes en el suero problema.

Elisa competitivo

• puede utilizarse para la determinacion de Ac o de Ag.
• Ac. se estrablece como una competencia entre los Ac del suero problema y un Ac secundario (conjugado)
• lla muestra se incuba con el Ag conocido para la formacion de los inmunocomplejos.
• luego se agrega el conjugado que contiene un Ac especifico secundario marcado enzimaticamente.
• este  Ac se unira al Ag libre del pocillo
• esta reaccion es la que se colorea.
•  es inversamente proporcional a la cantidad de aC presentes en la muestra.

ENA

Ac antinucleares extraibles pueden entregar informacion importante para evaluar a los pacientes que se sospecha que tienen ciertas enfermedades del Tej conectivocomo el LES, escleroderma, sind de Sjgren o polimiositis. 6 de los Ac mas utiles y que se analizan habitualmente en busca de ENAreaccionan con Ag de Sm, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, JO-1.

se han utilizado diferentes metodos para la deteccion de Ac anti SM, RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, JO-1, como ser la dobles difusion de OUCHterlony y la aglutinacion pasiva. el mas utilizado es la tecnica de ELISA, la que es objetiva, semicuantitativa, y s epuede testear un gran numero de pacientes.

Sm: son Ac muy especificos para LES, se le considera un Ac marcador de lupus. han sido incluido incluso dentro de los criterios del subcomite de artritis y reumatismo para la clasificacion del LES. la cantidad de Ac se ha considerado una medica fiable para la act. de la enf.

RNP: este Ac. se encuentra hasta el 45% de pacientes con lupus , asi como en otras enf. del tej conectivo. los AutoAnticuerpos de RNP se asocian con procesos patologicos benignos con escasa incidencia de transtornos renales y SNC.

SS-A(RO): se detectan autoanticuerpos anti SS-A  en un 40% – 60%  de pacientes con sindrome de Sjogreny en un 25-35% de pacientes con LES que son ANA positivo.

SS-B(LA): los autoanticuerpos SS-B se encuantran en un 5-15% de pacinetes con LES y un 25% de los pacientes con sind Sjogren.

SCL-70: la presencia de anticuerpos anti Scl-70 en suero humano puede ser utilizada en conjunto con hallazgos clinicos y otras pruebas de lab. como ayuda en el diagnostico de escleroderma.

Jo-1: la presencia de anticuerpos anti jo-1 y la deteccion de suero de pacientes ayuda al diagnostico de poliomiositis y otras enf. del tej conectivo.

Anti DNA: la presencia de Ac anti DNA de doble cadena se una en conjunto con hallazgos clinicos y otras pruebas de lab como ayuda en el diagnostico de LES. los Ac anti DNA de cadena doble solo se han practicamente de forma exclusiva en pacientes con LES y s eles considera un Ac marcador de esta enf.

separacion de poblacion linfocitaria

aislamiento de cel mononucleares de la circulacion sanguinea y medula osea.

estos procedimientos utilizan mezclas de polisacaridos y un medio de contraste radiopaque. HISTOPAQUE 1070 es una solucin de polisucrosa y diatrisoato de sodio, ajustado a una densidad de 1070+/- 0.001g/ml. este medio facilita la recuperacion rapida de cel mononucleares viables a partir de pequeñas volumenes de sangre. este procedimiento es util para estudios de linfolisis mediada por celulas y para tipificar HLA. tambien puede ser utilizado como paso de aislamiento inicial , precio al recuento de linfositos T y B.

sangre venosa con anticoagulante es depositada dentro de un tubo con HISTOPAQUE. durante la centrifugacion, eritrocitos y granulocitos son agregados por polisucrosa y rapidamente sedimentados, mientras los linfositos y otras celulas mononucleares permanecen en la interfase plasma – HISTOPAQUE. la contaminacion con eritrocitos es despreciable. la mayoria de las palquetas son removidas por centrifugacion a baja velocidad durante los pasos de lavado.

separacion de cel. mononucleares desde sangre periferica

las cel. mononucleares de sangre periferica pueden ser separadas de las otras cel sanguineas por centrifugacion en gradiente d densidad. para ello se puede utilizar una solucion comercial de Ficoll-Histopaque la cual e scolocada en un tubo y sobre esta una capa de sangre con heparina o EDTA. luego se realiza centrifugacion, luego delo cual se observa las capas celulares segun su densidad: las cel de baja densidad ( linfocitos y monocitos) quedan conformando la primera capa de cel; las cel de alta densidad ( PMN, eritrocitos, y tambien las plaquetas) quedan en el fondo del tubo. la capa de cel mononucleares puede ser removida con una pipeta plastica con extrema cuidado de retirar solo las cel ( evitando extraer el ficol-hepaque) una vez obtenidos los monoclucleares pueden ser utilizados para cultivo celular, identificarlos por citometria de flujo o inmunofluorescencia o otra tecnica.

si se quiere obtener granulocitos PMN, se puede utilizar el pellet que es rico en estas cel. sin embargo para ello deben ser eliminados los eritrocitos los cuales pueden ser hemolizados con una solucion isotonica y luego equilibrados con PBS ( buffer fosfato de sodio)

separacion de linfocitos T y B ( formacion de rosetas)

los linfocitos T expresan en su superficie CD2, las cuales interaccionan con moleculas LFA-3 (CD58) de la superficie de eritrocitos de oveja. luego del tratamiento con una enzima como neuromidasa o AET, la adhesion de moleculas de los eritrocitos de oveja pueden  interaccionar rapidamente con las moleculas de linfocitos T. de esta forma, varios eritrocitos de oveja pueden unirse a los linfocitos T formando posetas, las cuales pueden ser aisladas por centrifugacion en gradiente de ficoll. una franccion de aprox. el 95% de linfocitos T pueden ser aislados despues de una lisis isotonica de los eritrocitos.

las celulas que no forman rosetas flotan sobre la capa de ficoll y pueden ser aisladas y corresponden principalmente a linfocitos B.

procedimiento de separacion de cel mononucleares

1.- extraer mediante puncion venosa 20 mL de sangre con EDTA. mezclar.

2.- diluir la sangre en igual volumen con PBS 100 mM.

3.- colocar en un tubo conico de 15 mL, 1.5 de histopaque

4.- agregar 2 mL de sangre diluida cuidadosamente y centrifugar a 1200 xg por 15 minutos a 4ºC

5.- extraer con pipeta plastica la capa de plasma e histopaque. descartar.

6.- extaer con la pipeta plastica la capa de cel mononucleares, lavar con PBS y luego obseracr 10 ul cubierto con cubreobjetos, en microscopio con aumento de 40x